《硒甲基硒代半胱氨酸诱导乳腺癌MDAMB231细胞凋亡机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《硒甲基硒代半胱氨酸诱导乳腺癌MDAMB231细胞凋亡机制的研究（71页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、研究生个人简介姓名：黄秋性别：女年龄：2 5英语：大学英语六级已修学分：3 3 5学习及工作经历：2 0 0 6 0 9 “ 2 0 1 0 0 7 ，淮海工学院食品科学与工程专业，获工学士学位2 0 1 0 0 9 “ - 2 0 1 3 0 7 ，徐州医学院流行病与卫生统计学专业，获医学硕士学位研究生期间科研成果及获奖情况：2 0 1 2 年，中国全科医学，论文述一篇，已发表2 0 1 3 年，安徽科大学学报，论文一篇，已发表2 0 1 2 年，徐州市科技计划项目2 0 1 2 年，江苏省研究生创新计划目录缩略词表1中文摘要2A b s t r a c t 4前言6刖舌材料和方法1 01材
2、料1 02 方法1 3结果2 6讨论4 2结论。4 8参考文献4 9综述5 5攻读硕士学位期间发表学术论文6 6致谢6 7论文独创性声明6 8论文使用授权声明6 8论文审阅认定书6 9徐州医学院硕士学位论文缩略词B PD E P CD M S OE BF B S缩略词表A b b r e v i a t i o n英文全称B a s ep a i rD i e t h y l p y r o c a r b o n a t eD i m e t h y l S u l f o x i d eE t h i d i u m b r o m i d eF e t a lB o v i n eS e
3、 r u mG S H P xG l u t a t h i o n ep e r o x i d a s eh T E R TH u m a nt e I o m e r a s er e v e r s eM T TM S CM D AN B TO DP B SP C RR TR P MI 心1 6 4 0S O DT B A中文全称碱基对焦磷酸二乙酯二甲基亚砜溴化乙锭胎牛血清谷胱甘肽过氧化物酶端粒酶逆转录酶t m s c r i p t a s eM e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u m四甲基偶氮唑蓝S e M e t h y l
4、 s e l e n o e y s t e i nM a l o n d i a l d e h y d eN i t r o - b l u et e t r a z o l i u mO p t i c a l d e n s i t yP h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n eP o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nR e v e r s et r a n s c r i p t i o nR e v o l u t i o n sp e rm i n u t e硒甲基硒代半胱氨酸丙二醛氮蓝四唑光
5、密度磷酸盐缓冲液聚合酶链反应反转录每分钟转速D u l b e c c o SM o d i f i e dE a g l eM e d i u mR P M I16 4 0 培养基S u p e r o x i d eD i s m u t a s eT h i o b a r b i t u r i ca c i d超氧化物歧化酶硫代巴比妥酸徐州医学院硕士学位论文硒一甲基硒代半胱氨酸诱导乳腺癌M D A M B 一2 3l细胞凋亡机制的研究中文摘要目的本研究旨在从细胞水平研究硒一甲基硒代半胱氨酸( S e - M e t h y l s e l e n o e y -s t e i n ，
6、M S C ) 对人乳腺癌M D A M B 2 31 细胞凋亡、氧化应激、端粒酶活性和凋亡分子c a s p a s e 的影响，探讨其诱导细胞凋亡的作用机理，为硒一甲基硒代半胱氨酸作为营养强化剂应用于乳腺癌的辅助化疗，以及乳腺癌高危人群的营养预防提供理论和实验基础。方法1 不同浓度的M S C ( 1 2 5 9 a M 、2 5 9 M 、5 0 1 x M 、l O O p M 、2 0 0 I J M ) R P M I - 1 6 4 0培养液作用于人乳腺癌M D A - M B 2 31 细胞2 4 h 、4 8 、7 2 h ，M T T 法检测M S C 对细胞增殖的抑制作用
7、；H o e c h s t 染色法观察细胞凋亡形态。2 N B T 法检测M S C 对细胞超氧化歧化酶( S O D ) 活性的影响；T B A 法检测M S C 对细胞内丙二醛( M D A )水平的影响；比色法检测M S C 对细胞内总谷胱甘肽过氧化物酶( G S H P x ) 水平的影响。3 E L I S A 法检测端粒酶活性；R T - P C R 法检测细胞h T E R Tm R N A 基因的表达。4 W e s t e r n b l o t 法检测c a s p a s e 3 ，8 ，9 蛋白的表达。5 S P S S l 6 0 进行数据录入及统计学分析。结果1
8、M T T 法结果显示M S C 对M D A - M B 2 3 1 细胞的增殖具有抑制作用，同一时间细胞存活率随着M S C 浓度的增加而逐渐降低，同一浓度细胞存活率随着时间的增加而逐渐降低，各浓度组差异均有统计学意义( P 0 0 5 ) ，其余各浓度处理细胞后，各处理组细胞S O D 、G S H P x 活力活力弱于对照组，M D A 水平均高于对照组，差异有统计学意义( P 值一无细胞组( m 值1 4徐州医学院硕士学位论文( 3 ) 实验分组M D A - M B 一2 31 细胞，M S C 处理组( 0 9 M 、1 2 5 0 M 、2 5 r t M 、5 0 0 _ M
9、 、l O O p M 、2 0 0 9 M ) ，每浓度组细胞设3 个复孔。H U V E C 细胞，M S C 处理组( 0 0 M 、1 2 5 州、2 5 r t M 、5 0 r t M 、l O O p M 、2 0 0 1 a M ) ，每浓度组细胞设3 个复孔。2 3 细胞凋亡H o e c h s t 染色( 1 ) 检测原理：细胞发生凋亡时，染色质会固缩。H o e c h s t 3 3 2 5 8 染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡的细胞核会呈致密浓染，颜色有些发白。( 2 ) 检测步骤：M D A - M B 2 3 1 细胞接种于六孔板
10、上，培养至对数生长期后药物干预，刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0 5 m l 固定液，固定1 0 分钟或4 0 C 过夜；去固定液，用P B S 洗两遍，每次3 分钟，吸尽液体；加入o 5 m lH o e c h s t3 3 2 5 8 染色液，染色5 分钟。宜用摇床，或手动晃动数次；去染色液，用P B S 洗两遍，每次3 分钟，吸尽液体；每孔滴一滴抗荧光淬灭封片液，盖上洁净的盖玻片；荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。2 4B C A 法蛋白浓度测定取0 8 m l 蛋白标准配制液加入到蛋白标准( 2 0 m gB S A )中，充分溶解后配制成2 5 m g m l t 约蛋白标准
11、溶液。配制后可立即使用，也可以一2 0 。C 长期保存；取适量2 0 9 1 2 5 m g m l 蛋白标准，加入9 8 0 p l P B S 稀释至终浓度为O 5 m g m l 蛋白标准；根据样品数量，按5 0 体积B C A 试剂A 力l ：1 1 体积B C A 试剂B ( 5 0 ：1 ) 配制适量B C A工作液，充分混匀。B C 久作液室温2 4 d 时内稳定；将标准品按0 ，l ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0 9 1 3 H g J J 9 6 孑L 板的标准品孔中，力N P B S 溶液补足至l J 2 0 9 l 。J J l 2 0 9 l 待测样品至
12、1 J 9 6 孔板样品孔中；1S徐州医学院硕士学位论文各孔加入2 0 0 9 lB C A - V 作液，3 7 。C 放置3 0 分钟。用酶标仪5 6 2 n m 检测各孔吸光值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。2 5N B T 法检测总S O D 活性( 1 ) 检测原理：超氧化物岐化酶能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢( H 2 0 2 ) 和氧气( 0 2 ) ，是生物体内一种重要的抗氧化酶。N S T 法是一种基于N B T 的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中S O D P 超氧化物歧化酶活性方法。本方法采用经典的氮蓝四唑( N B T ) 显色，通过黄
13、嘌呤( X a n t h i n e )及黄嘌呤氧化酶( X a n t h i n eO x i d a s e ) 反应系统产生超氧阴离子( 0 2 - ) ，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲脱( f o r m a z a n ) ，后者在5 6 0 n m 处有强吸收。而S O D 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲躜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析可以计算出超氧化物岐化酶活性的水平。( 2 ) 检测步骤：M D A - M B 。2 3 1 细胞接种于六孔板上，培养至对数生长期后药物干预，终止培养后，用4 0 CP B S 洗涤1 2 遍。
14、用细胞裂解液裂解细胞，吸出裂解液至离心管，4 0 C 离心取上清作为待测样品。裂解宜在冰上操作；配制N B T I 作液：按照每1 8 m l S O D 检测缓冲液中加入5 0 肛1 N B T 的比例进行配制( 用S O D 检测缓冲液将N B T 稀释约3 6 倍) ，混匀后即为N B T I 作液。根据实验需要配制适当量的N B T I 作液，配制好的N B T - I _ 作液4 。C 现配现用；配制酶工作液：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每2 0 0 “l 稀释液中加入5 肛l 酶溶液的比例进行配制( 用稀释液将酶溶液稀释约4 0 倍) ，混匀后即为酶工作液；用9 6 孔板设置样品孔和空白对照孔。参考如下设置依次加入待测样品和其他各种溶液，加入酶工作液后充分混匀；徐州医学院硕士学位论文待测样品裂解液N B T 工作液酶工作液样品2 0 p l1 8 0 t l2 0 L t l空白对照1空白对照2空白对照32 0 1 x l1 8 0 1 x l2 0 I -
