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1、中国医科大学博士学位论文内毒素致新生大鼠肺血管内皮细胞和基膜改变的特点与肺出血 的关系姓名：杜悦申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：韩玉昆2002.10.1内毒素致新生大鼠肺血管内皮细胞和基膜改变的特点与肺出血的关系中文摘要前言新生儿肺出血是新生儿期常见危重症之一，起病急，早期不易发现，自临床应用肺表面活性物质替代疗法以来，应用表面活性物质治疗后仍死亡的早产儿中，其肺出血，尤其是肺泡内出血的发生率仍较高。病死率高达4 0 5 0 。新生儿肺出血的病因很多，包括窒息，感染，动脉导管未闭，寒冷损伤，早产儿，多血症，血液凝固异常等。但其病理生理机制仍不清楚。临床研究结果显示，新生儿弥漫性肺出血患
2、儿肺泡壁内的弹力纤维失去网状结构，血管基膜出现多处断裂；对肺出血新生儿监测肺动脉压力，发现肺出 血死亡患儿左室收缩功能降低。目前新生儿肺出血的高发人群主要包括早产儿，极低出生体重儿，宫内发育迟缓( I U G R ) 患儿。并发现早产儿肺出血与早产儿动脉导管分流及肺内血流量增多有关。近年来的基础研究显示，肺部毛细血管压力衰竭是造成肺出血的原因之一。这种压力衰竭可发生于肺部毛细血管基膜成分( 型胶原) 缺乏时，其结果可导致高通透性肺水肿或大面积肺出血。这种压力衰竭的病理改变包括：肺毛细血管内皮细胞层，上皮细胞层，有时甚至毛细血管壁全层断裂。这种病理改变与新生儿肺出血的病理改变基本一致，并且，早产
3、儿肺组织较新生儿肺组织发育不成熟，新生儿肺组织又较成年人肺组织发育不成熟，这种肺组织血管发育的差异可能是新生儿，尤其是早产儿易发生肺出血的原因之一。但是，必须要证明肺出血时存在肺血管的损伤，由于肺毛细血管存在内皮细胞和基膜的破坏，才使结构发育薄弱的新生儿肺组织在一些病因的作用下，易发生肺出血。目前，用内毒素制备成年大鼠A R D S 是已被公认的经典动物模型。感染也是新生儿发生肺出血的常见病因，但是，目前尚无研究新生儿肺出血发1 病机制的动物模型。因此，我们尝试用经典的致成年大鼠A U 及A R D S 的L P S 腹腔注射法来制备新生大鼠肺损伤和肺出血的动物模型，并与成年大 鼠对比，探讨内
4、毒素损伤新生大鼠肺组织的病理特点及其发病机制。在成人A R D S 患者中，已有研究表明，成人弥漫性肺损伤存在肺血管基膜的损伤，新生儿肺出血死亡患儿的病理也发现，肺毛细血管表现为基膜断裂。以上研究结果表明，血管基膜在肺出血的发病机制中起着重要的作用。所以，给新生大鼠腹腔注射内毒素，观察其不同时间点肺组织的病理改变，尤其电镜下观察L P S 作用后，肺毛细血管基膜是否发生断裂。血管基膜的成分主要包括型胶原和层粘连蛋白，采用W e s t e r nB l o t t i n g 和原位杂交的方法检测基膜的成分，型胶原和层粘连蛋白的含量及其m P t N A 在肺组织的表达改变，并与成年大鼠对比，
5、探讨新生大鼠易发生肺出血的原因。降解 型胶原和层粘连蛋白的M M P 系统中，采用免疫组化和l i t P C R 的方法 检测M M P 一2 及其抑制物T I M P 一2 的蛋白及其m R N A 在肺组织表达的变化。调节M M P 系统表达改变的主要因素是纤溶酶，而纤溶酶是在t P A 的作用下由纤溶酶原转变而来，所以，用R T P C R 的方法进一步研究t P A 及其抑制物P A I 一1 在肺组织中表达的改变，t P A 及其抑制物P A I 一1 均 由血管内皮细胞所分泌，同时检测肺血管内皮细胞分泌P E C A M l 的情况，以证实肺血管内皮细胞在新生大鼠肺出血的发病机制
6、中起着重要的作用，并说明是由于L P S 损伤了肺血管内皮细胞，首先是内皮细胞的功能和形态的改变，造成了基膜的损伤和局部的高凝状态，进而发生肺出血。以进一步阐明L P S 对新生大鼠肺组织的影响及其发病机制，为新生儿肺出血的治疗提供依据。实验材料与方法一、动物模型 用L P S 腹腔注射的方法制备新生大鼠动物( W i s t a r 大鼠，日龄7 天，体重1 2 1 8 9 ，共8 8 只) 模型，剂量为5 m g k g ，致伤后大鼠随机活动。将新生 大鼠随机分为8 组，生理盐水对照组( A ) ，L P S 注射后3 0 m 组( B ) ，l h 组( C ) ，2 h 组( D )
7、，4 h 组( E ) ，8 h 组( F ) 以上各组n = 8 ，1 6 h 组( G 组，n = 1 6 ) ， P A h 组( H 组，n = 2 4 ) ，其中1 6 h 组( G ) 死亡8 只，2 4 h 组( H ) 死亡1 7 只。所2 有存活动物按设定时间断头处死，立即打开胸腔，取右肺上叶留作提取R N A 用，右肺其余肺叶作光镜及电镜病理检查。成年大鼠随机分为7 组，对照组和L P S 给药组，于相同时间点处死( 无2 4 小时组) ，每个时间点8只。二、标本采集和处理各组大鼠分别于设定的时间点用5 戊巴比妥钠2 0 r a g k g 腹腔麻醉后，立即打开胸腹腔，观察
8、各脏器的改变，并取肺组织，按以下方式分别保存：1 于无菌条件下取材，取右肺上叶置于无R n a s e 的E p p e n d o r f 管中于液氮和一7 0 冰箱中保存。2 取右肺下叶置于0 1 D E P C 的4 多聚甲醛( 0 1 M P B S ，p H 7 0 7 6 ) 固定，2 4 小时内常规脱水及石蜡包埋。 3 取1 姗3 肺组织，2 5 戊二醛中固定。三、实验方法1 病理改变观察( 1 ) 大体观察：按照文献方法将肺出血分为5 级：I 级正常肺；I I 级肺水肿；1 1 I 级点状肺出血，肺组织可见大小不同的出血点；I V 级局灶性肺出血，肺组织可见小于两叶的小片状出血
9、；V 级弥漫性肺出血，肺组织可见面积达两叶以上的大片状出血。并同时观察肝，肾组织的大体改变。( 2 ) 光镜观察：肺组织固定后，2 4 小时内常规脱水及石蜡包埋，切片进 行常规H E 染色。光镜下观察。( 3 ) 透射电镜观察：l m m 3 肺组织固定2 4 小时后，洗净，l 锇酸固定，酒精梯度脱水，丙酮置换，浸透，E p o n 8 1 2 包埋，聚合，制成超薄切片，醋酸铀，柠檬酸铅复染，J E M 一1 2 0 0 E x 8 0 K v 透射电镜观察。2 肺组织血管基膜型胶原( C o l I V ) 和层粘连蛋白( L N ) 表达的检测( 1 ) 型胶原( C o l I V )
10、和层粘连蛋白( L N ) 蛋白水平的测定：采用W e s t -e l T lb l o t t i n g 方法检测C o l I V 和L N 在肺组织表达的变化。( 2 ) 型胶原( C o l l V ) 和层粘连蛋白( L N ) m R N A 水平的测定：采用原 位杂交技术检测肺组织c o l 和L Nm R N A 的表达。 3 肺组织M M P 一2 和T I M P 一2 表达的检测3 ( 1 ) 肺M M P 一2 和T I M P 一2 蛋白水平的测定：采用免疫组化方法检测 M M P - 2 和T I M P 一2 在肺组织表达的变化。 ( 2 ) 肺M M P 一
11、2 和T I M P - 2m R N A 水平的测定：采用R T P C R 技术检 测肺组织M M P 一2 和T I M P 一2m R N A 的表达。4 肺组织P E C A M 一1 ，t P A 和P A I l 表达的检测( 1 ) 肺P E C A M 一1 蛋白水平的测定：采用免疫组化方法检测P E C A M 一1 在肺组织表达的变化。( 2 ) 肺P E C A M 一1 ，t P A 和P A I 一1m R N A 水平的测定：采用R T P C R 技术检测肺组织P E C A M 一1 ，t P A 和P A l 一1m R N A 的表达。实验结果一、L P
12、S 注射后新生大鼠肺组织病理改变的观察1 大体观察自L P S 注射后0 5 小时肺组织即可见点状肺出血，给药后1 小时到8小时，肺出血的程度自局灶性到弥漫性逐渐加重，大鼠发生肺出血的数量也逐渐增多。但是，1 6 小时和2 4 J , B 寸存活组( G ，H ) 肺出血情况渐恢复。取 B 组为对照组作R i d i t 分析，其余各组与B 组比较后，除A 组外，P 均相 对 含 量L P S 注射后时间C o l m R a N AoL N _ R N A图1 4L P S 注射后新生大鼠肺组织型胶原和层粘连蛋白m R N A 表达的改变2 9 照片1 1 正常新生大鼠肺脏照片1 2L P
13、S 注射后8 小时新生大鼠肺脏：累及各个肺叶的大面积出血3 0 照片1 3 正常新生大鼠肺组织( 1 i e 染色X 4 0 0 )肺泡腔和肺泡间隔内有大量红细胞照片I 4L P S 注射后8 小时新生大鼠肺组织( t i e 染色x 4 0 0 )3 1 肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮结构正常，内皮连接存在，基膜连续，薄照片1 5 正常新生大鼠肺组织气血屏障超微结构( 电镜x 1 2 0 0 0 )基底膜完整，较厚照片1 6 正常成年大鼠肺组织气血屏障超微结构( 电镜x1 2 0 0 0 )3 2 内皮细胞间不连续，细胞间连接消失照片1 7L P S 注射后4 小时新生大鼠肺组织内皮细胞结构(
14、 电镜内皮细胞线粒体空泡变性照片1 8L P S 注射后4 小时新生大鼠肺组织内皮细胞结构( 电镜3 3 基膜变薄，断裂照片1 9L P S 注射后4 小时新生大鼠肺组织基膜结构( 电镜肺泡腔内可见红细胞照片1 1 0L P S 注射后8 小时新生大鼠肺组织出血情况( 电镜3 4 -l2345678从左至右：1 对照组；2 0 5 h ；3 1 h ；4 2 h ；5 4 h ；6 8 h ；7 1 6 h ；8 2 4 h照片1 1 1W e s t e r n 杂交检测I P 3 注射盾新生大鼠肺组织C o l 蛋白表达1234567从左至右：1 对照组；2 0 5 h ；3 1 h ；4
15、 2 h ；5 4 h ；6 8 h ；7 1 6 h照片1 1 2W e s t e r n 杂交检测L P S 注射后成年大鼠肺组织C o l 蛋白表达3 5 l2345678从左至右：1 对照组；2 0 5 h ；3 1 h ；4 2 h ；5 4 h ；6 8 h ；7 1 6 h ；8 2 4 h照片1 1 3W e s t e r n 杂交检测L P S 注射后新生大鼠肺组织L N 蛋白表达234567从左至右：1 对照组；2 0 5 h ；3 1 h ；4 2 h ；5 4 h ；6 8 h ；7 1 6 h照片1 1 4W e s t e r n 杂交检测L P S 注射后成年
16、大鼠肺组织L N 蛋白表达3 6 肺血管内皮细胞呈深棕黄染色照片1 1 5 新生大鼠对照组C o ll V m R N A 表达( 原位杂交4 0 0 )肺血管内皮细胞染色明显减弱照片1 1 6L P S 注射后4 小时C o lI V “ m R N A 表达( 原位杂交4 0 0 )3 7 肺血管内皮细胞呈深棕黄染色照片1 1 7 新生大鼠对照组L Nm R N A 表达( 原位杂交4 0 0 )肺血管内皮细胞染色明显减弱照片1 1 8L P S 注射后4 小时L Nm R N A 表达( 原位杂交X 4 0 0 )3 8 讨论内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜中以L P S 为主的成分，细菌死后或在快速生长过程中释放出来，是广泛存在于自然界的致病原。L P S是一类具有高度活性的大分子物质，是引起全身炎症反应综合征
