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1、兰州医学院硕士学位论文急性一氧化碳中毒病理机制的临床研究姓名：李自力申请学位级别：硕士专业：急诊医学指导教师：陈天铎;李培杰2003.5.1急性一氧化碳中毒病理机制的临床研究摘要目的探讨急性一氧化碳中毒( A C O P ) 患者血清丙二醛( M D A ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( G S H P x ) 、超氧化物歧化酶( S O D ) 活性及肿瘤坏死因子a ( T N F e L ) 、白细胞介素8 ( I L 一8 ) 水平的变化，探讨A C O P时自由基氧化损伤及炎症反应在急性一氧化碳中毒病理机制中的作用及意义。方法选择不同中毒程度的A C O P 患者7 0 例，分别于入院即刻、
2、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 抽血，测定血清中T N F 队I L 8 、M D A水平及S O D 、G S H P x 的活性。结果A C O P 时，中度中毒组与轻度中毒组比较，血清M D A水平升高，S O D 及G S H P x 活性水平降低，但均不具有显著性意义p O 0 5 ) ；重度中毒组与轻、中度中毒组比较，M D A 水平显著、性升高( P O 0 5 ) ；重度中毒组与轻、中度中毒组比较，血清T N F 0 【及I L 一8 水平显著性升高( p 0 0 5 ) ，c o m p a r e dw it hm il dg r o u p ( p
3、0 0 5 ) c o m p a r e dw i t hm i l dg r o u p ( 仄O 0 5 ) ，c o m n a r e dw i t hm i l da n dm o d e r a t eg r o u p图l 3 ：A C O P 患者血清G S H P x 水平变化趋势图F 嘻1 3 ：C h a n g i n gt r e n do fs e r u mG S H - P xi nt h eA C O Pp a t i e n t s兰州医学院坝学位论立讨论实验结果显示，A C O P 后血清M D A 水平明显增加，重度中毒组与轻、中度中毒组比较，有显著性
4、差异( 仄O 0 5 ) ，且高水平维持较长时间，这与国内临床观察结果相一致“，M D A 是脂质过氧化( L P D ) 的终末分解产物，是间接反映自由基氧化损伤的可靠指标“。A C O P 时由于组织严重缺氧及能量代谢障碍可出现内皮细胞肿胀，微血管收缩，部分毛细血管闭塞，微循环障碍h ”，及红细胞变形能力降低、血粘度增加呱”等病理生理过程。在随后给予的常压及高压氧治疗过程中，随着微循环的改善、组织供氧的恢复，组织存在着t 缺血一再灌注”的病理过程，存在着产生大量自由基的病理基础，缺血缺氧后细胞内黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶以O ：作为电子受体催化次黄嘌呤的酶促反应时，产生大
5、量超氧自由基，进而形成毒性更强的羟自由基( O H ) 。“：自由基具有极为活泼的反应性，可作用于生物膜上的不饱和脂肪酸，使之发生过氧化反应而形成脂质过氧化物( L i p i dP e r o x i d e sL P O ) L P O 可使细胞膜N a + 一K a + A T P 酶失活，膜通透性改变，溶酶体颗粒崩解，导致细胞功能障碍或坏死eA C O P 时血清M D A 水平的升高提示：A C O P 不仅有缺氧兰州医学院f 欧 学位论卫导致的直接组织损伤怍用，而且块血缺氧后自由基氧化损伤在A C O P 的病理损伤中也起着非常重要的作用，其可能为A C O P 时的又一重要病理基
6、础。动物实验显示。“，在A C O P 时，脑细胞脂质过氧化代谢产物M D A 水平升高抗氧化酶S O D 活性降低，提示脑防御自由基氧化能力降低，自由氧化损伤加重。与机f 本其它脏器比较由于脑细胞代谢最为活跃，对缺氧最敏感，最易产生自由基；且神经细胞富含多价不饱和脂肪酸，最易受自由基攻击等特点脑细胞更易受自由基的损伤。因此，A C O P 时，自由基氧化损伤在中枢神经系统损伤的病理过程中起着非常重要的作用，此可能为C O 中毒主要表现为中枢神经受损的又一主要原因。本实验显示，A C O P 患者血清S O D 、G S H P x 活性显著降低，重度中毒组与轻、中度中毒组比较，有显著性差异(
7、 仄O 0 5 ) ；提示A C O P 患者体内抗氧化能力明显降低；S O D 是机体内主要的抗氧化酶，是氧自由基的特异清除剂，S O D活性不足意味着自由基清除能力下降“；G S H P x 在细胞内能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，起到保护细咆结构和功能的作用m j 。G S H P x 水平下降，对自由基的清除能力降低，可导致大量脂质过氧化，形成组织损伤。A C O P 时S O D 及G S H P x 活性降低的原因可能是：L P O 生成过多消耗。，：境体内的5 L ! D 及G S H P x ：A C O P 时能量代谢严重障碍，S O D 、G S H P x
8、兰州距学院硕t 学位论史生成不足：C 0 直接抑制S O D 及G S H P x 活性。因此，A C O P 时给予抗氧化治疗，减轻自由基氧化损伤，对预防和减轻A C O P 时的病理损伤，特别是减轻神经组织的病理损伤有着十分重要的意义。抗氧化损伤治疗成为A C O P 救治过程中的又一重要方面。兰- 广学院碱J 学位论空结论A C O P 时，患者血清M D A 水平显著升高，S O D 、G S H P x 活性降低，提示机体抗氧化酶活性不足，对自由基的清除能力降低，自由基氧化损伤过程加重。提示A C O P 中不仅有缺血缺氧引起的直接损伤作用自由基氧化损伤等继发性缺血一再灌注”损伤电在
9、其病理机制中起着重要作用；其为A C O P 时的又一重要病理基础；因此，A C O P 时给予抗氧化治疗，减轻自由基氧化损伤，对预防和减轻A C O P 时的病理损伤，特别是减轻神经组织的病理损伤有着十分重要的意义。本实验为A c 。P 治疗中进行抗氧化治疗提供了依据；抗氧化损去治疗岁7成为A C O P 救治过程中的又一重要方面。同时，血清A 浓度水平及S O l 3 、G S H P x 活性水平也可作为病理损伤程度评估、病情及预后判定的指标之一。兰州K 学院坝二L 学位论文实验二：A C O P 炎症反应损伤的临床研究材料与方法一、研究对象及标准( 与实验一完全相同详见实验一)二、实验
10、仪器及试剂l _ 二般试剂：双蒸水、冰醋酸、无水乙醇等。2 特殊试剂：I L 8 、T N F o 检测试剂盒，试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。3 仪器、设备及实验条件：离心机( 3 5 0 0 R M ) 、低温冰箱、恒温水浴箱、加热器、微量加样枪、I 漓心管、自动Y l 计数器( G A 淞C 1 2 0 t 等l o三、实验标本采集分别于入院后即刻( 中毒后2 小时以内) 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 抽取肘静脉血3 m l ，分离血清，低温( - 7 0 “ C ) 保存待检。四、检测方法1 T N F Q 检测1 ) 检测原理：兰州I 晤学院坝小学位论义
11、放射免疫分析是利用特异性抗体( A b ) 与标记的抗原( 8 A g ) 和非标记抗原( A g ) 的竞争结合反应，通过测放射性复合物量来计算出A g 量的一种超微量分析技术：基本原理是：“竞争性结合的抑制反应”，体系中A g 、8 A g 具有相同的免疫活性，与特异性A b 具有相同的结合力，当两者同时与限量的A b 进行免疫结台反应时会彼此竞争，相互抑俐，反应服从质量守徊定律，是可逆过程，体系中A b 是给定的量，而。A g 和A g 的投入总量大于A b 上的结合点，二者竞争结合，并相互抑制，生成的“A g A b 的量受A g 量的制约，“A g A b的量随A g 量的增加而减少
12、，呈反比非线性函数关系，而未与A b 结合的呈游离状态的8 A g 的量则与A g 的量呈正比关系，即“A g A b 生成愈多或8 A g 愈少，则A g 量愈少，反之亦然；通过测定8 A g A b 或“A g 的放射性，即可间接推算出待测物的含量，关系可以用测得数据绘制的标准曲线表达。用一系列浓度递增的标准品在严格同样条件下8 A g 与A b 反应，以标准品的剂量为横坐标，以F F + B ( F ) 或B F + B ( B ) 为纵坐标，制得标准曲线，待测样品得到的F 或B 从标准曲线上求得含量。( F 游离部分放射性，B 结合部分放射性，T = F + B 总放射性)2 ) 试剂
13、盒组成与配制( 1 0 0 人份试剂盒) ：缓j 中液1 瓶( 1 0 m 1 ) ：用前加双蒸水稀释至5 0 m l ，配成P B S 液。抗T N F 血清1 瓶( 冻干品) ：用前加缓冲液1 0 5 m l 溶解。兰：! 壁兰坠堡：! ：兰些堡兰一一“卜一T N Fj 瓶( 冻干品。低温保存) ：用前加P B S1 0 5 m 1 溶解。T N F 标准品5 瓶( 冻干品，低温保存) ：用前加缓冲液O 6 m 1 ，其标准液浓度分别为0 3 ，0 9 ，2 7 ，8 1 ，2 4 3 n g m l 。稀释后的标准液放4 保存( 2 4 小时内使用) 。“0 ”标准品1 瓶，用前加P B
14、 S 液0 5 m l 溶解。P R 分离剂l 瓶：4 “ C 保存，用前充分混合。3 ) 测定方法：本试剂盒采用液相竞争法测定( 实验由兰医二院同位素室协助完成)取聚苯乙烯试管若干进行编号按表5 步骤进行操作：表5：TNFR I A 加样单位( u 1 )试剂N S BS 。S I - S 6样品缓冲液2 0 01 0 0T N T 标准1 0 0待测样品1 0 01 ”I - - T N F1 0 01 0 01 0 01 0 0抗T N F 血清1 0 01 0 01 0 0充分混合，放4 “ C 2 4 hP R 分离剂5 0 05 0 05 0 05 0 0。 加入分离剂后充分混匀，
15、放室温m i n ，4 “ C 离心0 0 R l2 5 r a i n ，吸。弃上清液，在自动、计数器上测定各管沉淀的放射性计数( C P M ) 。兰州K 学院耐! 【学位论业4 ) 结果计算：计算每双管C P M 的平均值；按下列公式计算各种标准物、质控血清和待测样品的B B 。B Bo ：皇! 翌竺2 = 丝塑! 翌竺2 。1 0 0 B o ( e p m ) 一N S B ( c p m )B = 每对试管C P M 的均值，B 产0 标准物C P M 的均值以各标准物的B B 描为纵坐标，浓度为横坐标在L o g i t l o g 坐标纸上绘制曲线：待测血清和质控血清中I L
16、一8 含量可在标准曲线上查出，或经自动Y计数器R I A 程序自动得出。2 。I L 一8 检测1 ) 检测原理放射免疫分析是利用特异性抗体( A b ) 与标记的抗原( 2 A g ) 和非标记抗原( A g ) 的竞争结合反应，通过测放射性复合物量来计算出A g 量的一种超微量分析技术：基本原理是：“竞争性结合的抑制反应”，体系中A g 、。A g具有相同的免疫活性，与特异性A b 具有相同的结合力，当两者同时与限量的A b 进行免疫结合反应时会彼此竞争，相互抑制，反应服从质量守恒定律是可逆过程t 体系中A b 是给定的量，而4 A g 和A g 的投入总量大于A b 上的结兰州医学院硕1 。学位论文含点，二者竞争结合，并相互抑制，生成的“A g A b 的量受A g 量的制约，“A g A b的量随A g 量的增加而减少，呈反比非线性函数关系
