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1、 11-05 高效率逆转录试剂盒 高效率逆转录试剂盒 First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace - (Code No. FSK-100,FSK-101) 使用说明书使用说明书 科研用科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目 录 目 录 【1】 简介简介.1 【2】 RT-PCR法的原理法的原理.2 【3】 试剂盒的组成试剂盒的组成 .3 【4】 操作步骤操作步骤 .5 【5】 添付引物的说明添付引物的说明.7 【6】 处理处理RNA过程中的注意事项过程中的注意事项.7 【
2、7】 进行进行RT-PCR过程中的注意事项过程中的注意事项.8 【8】 参考文献参考文献 .8 【9】 常见问题常见问题 .9 【10】相关产品】相关产品 .11 【 注意注意 】 本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用过程中，请严格遵守实验室作业的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。 组分中的5RT Buffer在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时，请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。 【 保存保存 】 除Positive Control RNA以外，其他组分请均保存于-20条件下。 Po
3、sitive Control RNA请保存于-80条件下。 Positive Control RNA由于运输过程中不能一直保证由于运输过程中不能一直保证-80条件，在运输过程中可能降解。建议用户选择人、鼠来源的条件，在运输过程中可能降解。建议用户选择人、鼠来源的Total RNA 作为作为Control RNA。 为了保证实验效果，请在收到产品的一年之内使用完毕。 【1】 简介简介 将逆转录 (Reverse Transcription；RT)反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction) 反应组合在一起的 RT-PCR法， 是能够比较简便和迅速地检测来自多个样品的RN
4、A的检测方法。所以，近年来作为一般的方法被广泛应用于mRNA表达有无、表达量、长度的异常等RNA的分析和cDNA克隆中。 本公司利用基因工程学的方法改变了来自 MMLV (Molony murine leukemia virus) 的逆转录酶，使阻碍合成长链 cDNA 的 RNase H失活，成功开发了大幅度提高 cDNA合成能力的改良型酶ReverTra Ace 。 ReverTra Ace -(Code No.:FSK-100,FSK-101)是以ReverTra Ace为核心酶的First strand cDNA合成试剂盒。由于本试剂盒包含了RT用引物及Positive Control，
5、所以能够简单地进行逆转录反应。也可以应用于手头上各种DNA聚合酶的PCR反应模板的制备。例如，通过和High fidelity PCR用酶，Long PCR用酶等的结合，能够进行目的性更强的RT-PCR。 本产品特征本产品特征 1. 高高cDNA合成能力合成能力 本产品中使用的ReverTra Ace是大幅度提高cDNA合成能力的改良型酶,已确认能够合成14kb以上的cDNA 。 2. 高检测灵敏度高检测灵敏度 由于对ReverTra Ace -进行了最优化处理，即便带入全量的逆转录反应液也不会对PCR反应造成阻碍，所以可以使用各种DNA聚合酶，在同一个离心管中进行RT反应和PCR反应。 ht
6、tp:/www.bio- 1东洋纺（上海）生物科技有限公司 【2】 】 RT-PCR 法的原理法的原理 RT-PCR法，如图1所示：由从模板RNA开始合成First Strand cDNA的逆转录反应步骤， 和以此cDNA为模板合成Second Strand cDNA， 并对目的遗传基因片段进行扩增的PCR步骤组成。 RN APrim er5353Reverse Transcription (Synthesis of the First Strand cDN A)Reverse TranscriptaseReverTra Ace 53cDNASynthesis of the Second St
7、rand cDNADNA Polym eraseAm plificationDNA Polym eraseRTPCRReverTra Ace -图1. RT-PCR法的原理 垂询电话：021-58794900 2【3】 试剂盒的组成试剂盒的组成 FSK-100 FSK-101 No 组成成分 50 次份 100 次份 1 ReverTra Ace 50l 100l 2 RNase lnhibitor(10U/l) 50l 100l 3 200l 400l 5RT Buffer(含有 25mM MgCl 2) 4 dNTP Mixture(各 10mM) 100l 200l 5 RNase Fr
8、ee H2O 600l 1200l 6 (10pmol/l) 50l 100l Oligo(dT) 20 7 Random Primer (25pmol/l) 50l 100l 8 Control Primer F(10 pmol/l) 25l 50l 9 Control Primer R(10 pmol/l) 25l 50l 10 Positive Control RNA( (10 5copies/l) ) 25l 50l 除除Positive Control RNA外，所有组分请均保存在外，所有组分请均保存在-20条件下；条件下；Positive Control RNA请保存于请保存于-8
9、0条件下。条件下。 Positive Control RNA 由于运输过程中不能一直保证由于运输过程中不能一直保证 -80条件，在运输过程中可能 降解。建议用户选择人、鼠来源的条件，在运输过程中可能 降解。建议用户选择人、鼠来源的 Total RNA 作为作为 Control RNA。 组分中的 组分中的 5RT Buffer 在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时， 请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。 在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时， 请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。 各引物的序列 各引物的序列 Oligo(dT)
10、Oligo(dT) 2020 5-(dT)-3 20Random Primer Random Primer 5-(dN)9 -3 Control Primer F(G3PDH)Control Primer F(G3PDH)* *5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 (20mer) Control Primer R(G3PDH)Control Primer R(G3PDH)* *5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 (20mer) 添付的引物 添付的引物 通过添付的 G3PDH 遗传基因用序列特异性引物（Control Primer F、R）可得到 450bp 的 PCR
11、 产物。此引物除了可对来自 Human 的 G3PDH 遗传基因进行扩增之外，还可用于 Rat、Mouse、Swine 等由来的 G3PDH 基因。G3PDH遗传基因属于“管家基因”(Housekeeping Gene)，除 Control RNA 外，还适用http:/www.bio- 3东洋纺（上海）生物科技有限公司 于大部分 Total RNA。 另外，还添加了Oligo(dT) 20、Random Primer。关于这些引物的选择，请参照后面的“添付引物的说明” （P7） 。 使用此引物组过程中，有可能从基因组 DNA 得到和从 cDNA 而来的扩增产物相同大小的扩增产物。这可能是来自
12、于假基因的缘故。因此，在进行RT-PCR 反应时，建议使用经 DNase处理的 RNA。 Primer F 559G3PDH mRNA 12371110intron Primer RSize(bases) 1634 90 129 9092k-193104图 2. Control Primer F，R 的 location Positive Control RNA 本 试 剂 盒 作 为 Positive Control 用 RNA ， 添 附 有 Human G3PDH (Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)遗传基因的 in vitro 转录产物。（在 3末端添加了 22mer 的 Poly（A）tail） （请参照图 3） 。 G3PDH 基因是在各种哺乳类组织上表达的“管家基因” 。其 mRNA 表达水平不受一部分细胞因子和含有 Tumor-promoting Phorbol Esters 等的诱导物质的影响，并且，在几乎所有组织上都是恒定的。因此，使用从各种组织中抽提出来的 RNA 样品的时候，可以作为最合适的对照而使用。 hG3PDH RNA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Poly(A) (22mers)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Primer RPrimer F图 3.
