《生态制剂预防溃疡性结肠炎复发的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生态制剂预防溃疡性结肠炎复发的实验研究（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一军医大学硕士学位论文生态制剂预防溃疡性结肠炎复发的实验研究姓名：崔海宏申请学位级别：硕士专业：内科学（消化系病）指导教师：陈村龙20030525中英文缩略语词表英文缩写英文全称A c r B i sa c r y l a m i d e N ，N - b i s a c y l a m i d eB DB Lo pC B BG 一2 5 0C DC F U山姐 PD E P Cd N T PD T TB CE D T A E 叽AE mE M S AE SG A P D HH E P E SI L - 1 B，8L CN F r Bo Db a c t e r o i d e sb i f
2、 i d o b a c t e r i u mb a s e p a i rc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eG 2 5 0c l o s t r i d i u mc l o n ef o r m i n gu n i td e o x y a d e n o s i n et r i p h o s p h t ed i e t h y lp y r o c a r b o n a t ed e o x y n u c l e o s i n et r i p h O S p h t ed i 山o i o t h r e i t o le
3、 n t c r o c o c c u se t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i de t h y l e n e g l c o l - b i s ( 1 ，- a m i n o e t h y le t h e r ) - N ，N N ，N - t e t r a c e t i ca c i de n t e r o b a c t e r ae l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a ye u b a c t e r i u mg
4、l y c e r a l d e h y d e s3p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eN - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N - 2e t h a n e s u l f o n i ca c i di n t e r l e u k i n 1b e t ai n t e r l e u k i n 8l a c t o b a c i l l u sn u c l e a rf a c t o rk a p p aBo p t i c a ld e n s i t
5、y1 中文全称丙烯酰胺，N ，N 双丙烯酰胺拟杆菌双歧杆菌碱基对考马斯亮蓝小梭菌菌落形成单位脱氧腺苷三磷酸焦碳酸二乙酯脱氧核苷三磷酸二硫苏糖醇肠球菌乙二胺四乙酸乙二醇双( 乙氨基乙醚) 四乙酸肠杆菌电肃壬j | 鍪阳妊盼析真杆菌甘油醛3 磷酸脱氢酶N - 2 羟乙基哌嗪_ N - 2 一乙磺酸白细胞介素l B白细胞介素8乳杆菌 核转录因子让光密度P M S FP SS PS bR T P C RT B ST ET E M 匝DT hT N F aT r i sT r i S H C lU Cp h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d
6、 ep e p t o c o c c u sS t a p h y l o c o c c u ss a c c h a r o m y c e sr e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nT d S b u f f e r e ds a l i n eT d S E D T Ab u f f e rN ，N ，N ，N - t e t r a m e t h y le t h y l e n e - d i a m i n eT h e l p e rt u m o rn
7、 e c r o s i sf a c t o rqN - t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n eN - t r i s h y d r o x y m e t h y lA m i n o m e t h a n e H C lU l c e r a t i v ec o l i f i s苯甲基磺酰氟消化球菌葡萄球菌酵母菌逆转录一聚合酶链反应“ I r i s 缓冲盐水三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液四甲基乙二胺T 辅助细胞肿瘤坏死因子nN 三羟甲基氨基甲烷N _ 三羟甲基氨基甲烷氯化氢盐溃疡性结肠炎中文摘要溃疡性
8、结肠炎( U l c e r a t i v ec o l i t i s ，U C ) 的发病机制仍未明确，大多数学者认为，它是基因的易感性，肠道细菌及自身免疫反应协同作用的共同结果。尽管目前尚未找到明确导致U C 的致病菌，但肠道常驻菌群间的失衡已经得到学者们的公认。当前U C 治疗仍以糖皮质激素类、柳氮磺胺类和免疫抑制剂等药物为主，但有副作用大，停药后易复发等缺点。K a r e n 等1 1 尝试应用包括双歧杆菌( B f ) 在内的三种活菌的生态制剂治疗对5 一氨基水杨酸耐药的患者，其作用已经得到有效的肯定。本研究首先探讨菌群失调与肠道炎症的关系，再通过菌群分析，分子免疫学等方法检测
9、双歧三联活菌延缓U C 患者复发时间的机制，旨在从分子水平上探讨生态制剂对U C 的影响，以期能为临床应用生态制剂治疗U C 提供证据。方法一、4 1 例临床诊断为U C 患者的粪便标本用快速菌群涂片法分为I 度菌群失调和I I 度菌群失调；做病理切片并肠镜下活检粘膜组织经总R N A 抽提、R T - P C R 分析致炎细胞因子在转录水平的表达。用统计学方法分析菌群失调与炎症的关系；二、1 急性期重症U C 患者3 0 例，经临床治疗病情缓解后，给予口服双歧三联活菌胶囊治疗，对照组给予安慰剂，两个月后观察患者复发情况；2 菌群分析：采用光冈知足改良法，检测治疗组和对照组治疗前后1 0 种肠
10、道常驻菌；3 逆转录一聚合酶链反应( R 1 P C R ) 技术，对处理前后患者肠粘膜内耵吓如、，l D 和I L - 8 的表达水平进行半定量测定。4 N F - r B 活性测定：应用免疫电泳迁移率改变分析( E l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y , E M S A ) 法检测治疗前后患者肠粘膜细胞核中N F K B与D N A 结合的活性；5 检测核转录因子及其抑制蛋白的聚集：用w e s t e m - b l o t 技术，对治疗前后患者肠粘膜细胞核中的N F - r 。B 及细胞浆中I r ,
11、 B 的聚集测定；结果1 随着菌群失调程度的增加，病理切片下可见粘膜固有层明显水肿，中气性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞大量浸润炎症细胞因子m R N A 的表达也随之增加；2 治疗组患者口服双歧三联活菌胶囊两个月后U C ，对照组1 4 例( 9 3 ) 复发U C 。及腺体破坏逐渐加重。其中3 例( 2 0 ) 复发3 两组病人治疗前菌群分析无明显差异，但明显与正常人不同，细菌总数下降，G + 杆菌数目明显减少；治疗后服用双歧三联活菌组患者粪便菌群分析：肠球菌，双歧杆菌和乳杆菌及拟杆菌的数量显著增加( P 0 0 5 则为无显著性差异。每一个实验结果至少重复三次。结果一、菌群涂片正常对照组粪
12、便涂片油镜观察可见细菌总数较多( 1 0 0 0 个，视野) ，其中以G r a m 阳性杆菌占多数( 5 0 - - 7 5 ) ，其次为G r a m 阴性杆菌( 约占2 0 ) ，其余为G r a m 阳性球菌( 1 0 左右) ，正常菌群可见大量G + 杆菌，随着菌群紊乱程度的增加，细菌数量逐渐下降，G + 杆菌显著减少。旷杆菌明显增加。U C 患者I 度菌群失调的粪便呈软稀便，细菌数量减少( 3 0 0 5 0 0 个，视野) ，G r a m 阳性杆菌占( 4 0 - 5 0 ) ，其次为G r a m 阴性杆菌( 约占3 0 ) ，其余为G r a m 阳性球菌( 0 0 5 则
13、为无显著性差异。每一个实验结果至少重复三次。结果一、菌群分析两组病人治疗前菌群没有明显差异，治疗后培菲康组患者菌群中肠球菌( 7 2 0 o 6 7 ，P 0 0 5 ) & 9 2 杆菌( 7 6 0 型- - 0 9 3 ，P 0 。0 5 ) ，双歧杆菌( 8 6 9 0 3 4 ，一2 9 P O 0 1 ) 和乳杆菌( 7 3 9 _ + 0 6 9 ，P O 0 5 ) 的数量显著增加，而酵母菌( 3 0 7 0 8 3 ，P O 0 5 ) 的数量明显下降；而安慰剂组患者的菌群中双歧杆菌( 6 4 4 0 4 6 ，P O 0 1 ) 和乳杆菌( 6 6 9 _ + 0 5 5
14、，P O 0 5 ) 明显下降，肠杆菌( 8 9 4 - + 0 8 9 ，P O 0 5 ) 明显升高。( 表5 ，图9 )表5 治疗前后菌群分析结果f 又S 。L 9 1 0 “ t g )注：两组治疗前后的比较为配对t 检验，t P O 0 5 ，t + P 0 0 1 ；培菲康治疗组与对照组比较为独立样本的t 检验，+ P O 0 5图9 治疗前后菌群分析3 0 -图1 0 治疗前患者粪便涂片图1 1 对照组患者粪便涂片图1 2 服用培菲康后患者粪便涂片二、N F r d 3 p 6 5 及I r B 表达的检测：两组病人治疗前后纤维结肠镜下取肠粘膜，分离肠粘膜上皮细胞，分别提取细胞浆
15、和核蛋白，W e s t e r nb l o t分析细胞浆蛋白检测I r _ B 发现：患者服用培菲康后I r , B 很少降解，而对照组细胞核中N F J c B p 6 5 聚集较多( 尸 0 o i ) 。( 图1 3 、1 4 ，表6 )1 2 治疗前N F r , B p 6 5 在核内的聚集；3 治疗组N F 一1 | d 3 p 6 5在核内的聚集；4 对照组N F r , B p 6 5 在核内的聚集；图1 3 胞核内N F r , B p 6 5 的聚集1 2 治疗前I r d 3 在胞浆中的聚集；3 治疗组I r , B 在胞浆的聚集；4 对照组I r , B 在胞浆内的
16、聚集图1 4 胞浆内I K B 的聚集表6 两组治疗前后N F r , B ( 胞核) 与I r , B ( 胞浆) 聚集结果O D 值( m e a n + S D )注：培菲康组与对照组比较为非配对的r 检验，+ P 0 0 5 ；治疗前后比较为配对f 检验，4 P 00 5 ，$ 8 P 0 OL 。三、D N A 连结N F K B 的激活：两组患者治疗前后纤维结肠镜下取肠粘膜，分离肠上皮细胞，提取细胞核蛋白，行E M S A 分析，检测N F 一1 出与D N A 的结合活性，结果分析发现：对照组U C 患者抗生素停用后N F r , B的激活增多，与治疗前有显著差异( P 0 0 1 ) ；而治疗组患者，未出现N F r d 3 的激活( P 0 0 1 ) 。( 图1
