《南方水稻黑条矮缩病毒分子检测方法的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《南方水稻黑条矮缩病毒分子检测方法的研究（85页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、S T U D I E SO NM O L E C U L A RM E T H O D SF O RD E T E C T I O NO FS O U T H E R NR I C EB L A C K S T R E A K E DD W A R F R U SB yD uL i n l i nAd i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt oN a n ji n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yI nP a r t i a lF u l f d l m e n to f t h eR e q u
2、i r e m e n t sf o rM a s t e rD e g r e e一- S u p e r v i s e dB yP r o f e s s o rZ h o uY i ju nD e p a r t m e n to fP l a n tP a t h o l o g y , C o l l e g eo fP l a n tP r o t e c t i o nN a n j i n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yN a n j i n g2 1 0 0 9 5 ，P R C h i n aJ u n e ，2 0
3、 1 2原创性声明l I I I I i l1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1H lY 2 3 6 0 2 7 7本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者( 需亲笔) 签名：杠琳磷朱冽2 年石月驴日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留
4、并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。( 请在以上方框内打“”)学位论文作者( 需亲笔) 签名：杜琳砩札导师( 需亲笔) 签名：加J 2 年6 月吕日2 。z 年月 日目录目录摘要IA B S T R A C T ：I I I第一部分文献综述一l第一章南方水稻黑条矮缩病毒研究进展11 分类地位12 病毒粒子的基本特征23 病毒粒子在宿主植物和介体飞虱体内的分布24 病毒的基因组结
5、构35 寄主范围及分布46 病害症状57 传毒介体67 1 白背飞虱的生物学特性一77 2 传毒特征。88 病害发生规律9第二章植物病毒检测方法研究进展1 11 生物学方法1 12 电镜观察法123 免疫检测方法：1 23 1 酶联免疫吸附测定法1 23 2 免疫印迹检测1 33 3 免疫胶体金技术1 33 4 免疫捕获反转录P C R 144 分子检测方法。1 44 1P C R 技术1 54 2 逆转录环介导等温扩增方法( R T - L A M P ) 18第二部分研究内容2 3第三章南方水稻黑条矮缩病毒两种检测方法的建立2 3第一节R T - L A M P 快速检测方法的建立2 3l
6、 材料方法2 41 1 材料一2 4南方水稻黑条矮缩病毒分子检测方法的研究1 2 方法。2 52 结果2 82 1I m L A M 口优化2 82 2R T - L A M P 与R T - P C R 灵敏性比较及核酸染料检测R T - L A M P 产物3 02 3 特异性检测+ 312 4 水稻和玉米组织中S R B S D V 检测结果3 23 讨论3 2第二节R e a lt i m eR T - P C R 测定S R B S D VR N A 拷贝数方法的建立3 41 材料方法3 41 1 植物材料3 41 2 方法3 42 结果4 02 1S R B S D VS 9 重组
7、质粒的制备及鉴定4 02 2R e a lt i m eR T - P C R 反应体系及条件优化。4 22 3 标准曲线及熔点曲线“2 4 与R T - P C R 灵敏性比较4 63 讨论4 6第四章南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较研究4 91 材料方法一4 91 1 材料4 91 2 方法5 02 结果5 52 1 灵敏性检测5 52 2 检测寄主植物的特异性5 62 3 检测昆虫介体的特异性5 83 讨论6 l参考文献6 5附录7 3在读硕士期间发表论文。7 5致谢7 7摘要南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的研究摘要南方水稻黑条矮缩病毒( S o u t h e r nr i c eb
8、l a c k - s t r e a k e dd w a r f v i r u s ，S R B S D V ) 为呼肠孤病毒科( R e o v i r i d a e ) 斐济病毒属( F i j i v i r u s ) 第2 组的一个建议新种。主要由白背飞虱( S o g a t e l l a f u r c i f e 阳) 以持久性不经卵方式传播，侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病。疑似病株的田间诊断及白背飞虱带毒率测定是病害流行预测的重要因子。当前常用的方法，如生物学方法、免疫学方法、分子生物学方法，存在耗时长、操作复杂及成本高等缺陷，难以满足快速、准确
9、、低成本的检测要求，也不能实现病毒R N A 拷贝数的定量。另外，感染S R B S D V 的水稻植株与水稻黑条矮缩病表现类似症状，且在基因组序列、病毒粒体形态、症状、寄主范围、传毒介体及血清学等方面也非常相似，传统检测方法很难将它们区分。有必要建立适用于不同要求和场所的检测方法来满足实际需求。为了满足快速、简便、低成本、高特异的要求，本研究建立了逆转录环介导等温扩增方法( R T - L A M P ) 。针对S R B S D VS 9 核苷酸序列保守区域设计4 条L A M P 特异性引物( F 3 ，B 3 ，F I P , B I P ) ，从引物浓度、M g S 0 4 浓度及反
10、应温度、时间几个方面对R T - L A M P 方法进行优化。确定引物浓度比为l ：8 ( F 3 愿3 终浓度0 2l a M ，F I P B I P 终浓度1 6 州) ，M g S 0 4 终浓度8m M ，6 0 6 2 “ ( 2 恒温反应6 0m i n 为适宜实验条件。本R T - L A M P 方法的灵敏， 生是R T - P C R 方法的1 0 倍，能够排除R B S D V 的干扰而特异的检测S R B S D V ，适合寄主植物和介体体内S R B S D V 的快速检测。为了实现病毒R N A 拷贝数的准确定量，本研究建立了R e a lt i m eR T - P C R 检测方法。根据S R B S D VS 9 核苷酸序列
