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1、河北医科大学硕士学位论文金雀异黄素抗结肠癌作用及其机制的体内外实验研究姓名：范玉贞申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：王玉华20080301河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。一一一、研究生签名：范) 玉疋导师签名彩事学院领导签名：加口君年弓月z g 日河北医科
2、大学 研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生繇擞导师躲彩彳如夕8 年1 | ；月gE l 。一鬈鳟簪蜂，一霎一戏印- 中文摘要金雀异黄素抗结肠癌作用及其机制的 体内外实验研究摘要目的：通过体内外实验研究金雀异黄素( G e n i s t e i n ，G e n )对结肠癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响，探讨G e n抗结肠癌的作用机制，为寻求结肠癌治疗新的药物提供理论依据。方法：l 体外实验：体外培养人结肠癌细
3、胞S W 4 8 0 ，采用四甲基偶氮唑蓝( t e t r z o l i u m b a s e dc o l o r i m e t r i ca s s a y , M T T )比色法测定G e n 对该细胞的增殖抑制作用，选择合适的实验剂量；采用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率；普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变；采用流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，F C M ) 半定量检测G e n 诱导人结肠癌细胞凋亡过程中相关蛋白P C N A 、P 2 1 、V E G F 的表达情况。2 体内实验：取健康雄性B A L B c 小鼠( 6 0 只)
4、 称重，采用随机数字法将小鼠随机分为5 组( 每组1 2 只) ：对照组( 生理盐水) ；G e n 低剂量组( 1 m g k g ) ；G e n 中剂量组( 1 0 m g k g ) ；G e n高剂量组( 2 0 m g k g ) ；5 氟尿嘧啶组( 5 - F u ) 。将c o l o n 2 6细胞皮下接种于各组小鼠，建立荷瘤小鼠模型。当各组小鼠可触及到瘤体时开始给药，采用腹腔注射给药方式：对照组给予含二甲基亚砜( D M S 0 ) 的生理盐水0 2 m l ( D M S O 9 8 ) ：陕西慧科生物股份有限公司产品5 氟尿嘧啶( 5 F u ) ：天津金耀氨基酸有限公
5、司产品氯化钾( 分析纯) ：中国医药集团上海化学试剂公司产品氯化钠( 分析纯) ：北京化学试剂公司产品碳酸氢钠( 分析纯) ：天津市医药公司产品磷酸二氢钾( 分析纯) ：北京化工厂产品磷酸氢二钠( 分析纯) ：天津市化学试剂厂产品四甲基偶氮唑蓝( M T T ) ：北京华美生物工程公司产品R P M I 1 6 4 0 培养基：美国G I B C O 公司产品D M E M 培养基：美国G I B C O 公司产品胰蛋白酶：美国G I B C O 公司产品胎牛血清：杭州四季青生物材料公司产品二甲基亚砜( D M S O ) ：北京化工厂产品多聚赖氨酸：美国S a n t aC r u zB i
6、 o t e c h n o l o g y 产品鼠抗人单克隆抗体P C N A ：美国S a n t aC r u z 产品鼠抗人单克隆抗体V E G F 美国S a n t aC r u z 产品鼠抗人单克隆抗体P 2 1 ：美国S a n t a C r u z 产品P C N A ( 鼠单抗I g G ) ：美国S a n t aC r u z 公司产品V E G F ( 兔多抗I g G ) ：美国S a n t aC r u z 公司产品P 2 1 ( 鼠单抗I g G ) ：美国S a n t aC r u z 公司产品D A B 显色试剂：河北博海生物工程有限公司产品研究论文1
7、 4 主要仪器超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品( S W 二C J I F )C 0 2 恒温培养箱：美国S H E L D O N 产品( S H E L I A B 2 3 2 3 )台式离心机：德国H e r a e u s 公司产品( L a b o f u g e 4 0 0 ) 超低温冰箱：日本S A l W O 产品( M D F 3 8 2 F 型)博赛酶标仪：郑州博赛生物工程公司产品( H T 2 1 2 5 5 ) 普通光学显微镜：日本O n M P Y S 公司产品电光分析天平：上海天平仪器厂( T G 3 2 8 1 3 )透射电镜：日本日立公司( H
8、7 5 0 0 型)多功能真彩色细胞图象分析管理系统：美国M e d i aC y b e m e t i c s 公司流式细胞仪检测条件及参数：美国B a c k m a nC o u l t e r 公司生产的E p i c s X L I I 型流式细胞仪，激发光源为1 5 m W 氩离子激光器，激发波长4 8 8 n m ，E x p 0 3 2 A D C 进行免疫荧光分析，用M u l t i c y c l eA V 分析软件对D N A 细胞周期拟和分析。 2 方法2 1 体外实验2 1 1 药物配制2 1 1 1G e n 的配制用二甲基亚砜( D M S O ) 溶解，配制
9、成4 m g m l 的储备液 - - 2 0 储存。用D M E M 培养液稀释至所需浓度。D M S O 在各组培养液中终浓度低于0 0 5 。2 1 1 2D M E M R P M I 1 6 4 0 培养液的配制将D M E M RM I 干粉培养基一袋( 1 3 4 9 ) 于l L 三蒸水中充分溶解，0 2 2 9 m 的滤膜过滤除菌分装，- - 2 0 。C 保存备用，研究论文用时加入青霉素和链霉素，其终浓度均为1 0 0 U m l 。2 1 1 3M T T 溶液的配制用P H 值为7 4 的0 ，l m o l L 的P B S 将其配制成5 m g m l浓度，并用一次
10、性无菌小滤器过滤除菌，分装，4 。C 保存。2 1 1 4P B S 液的配制氯化钾0 2 9 、氯化钠8 9 、磷酸二氢钾0 2 4 9 、磷酸氢二钠3 4 9 9 ，加双蒸去离子水溶解至1 0 0 0 m l ，振荡摇匀，高压蒸汽灭菌，置于4 备用。2 1 1 5O 2 5 胰酶的配制：胰蛋白酶O 5 9 ，0 0 4 9 E D T A ，溶于2 0 0 m l P B S 液中，O 2 2 9 m滤膜过滤除菌、分装，4 。C 保存备用。2 1 2 细胞培养结肠癌细胞S W 4 8 0 培养于含l O 胎牛血清的D M E M 培养基中，置于3 7 。C 、饱和湿度、5 C 0 2 的培
11、养箱中培养，根据细胞生长情况，每2 3 天换液一次，待细胞生长状态稳定，呈对数生长期时收集细胞，用于实验。2 1 3M T T 比色法检测S W 4 8 0 细胞的增殖取对数生长期的S W 4 8 0 细胞，用0 2 5 的胰酶消化，1 0 0 0 r m i n ，5 m i n 离心沉淀细胞。用少量D M E M 培养液悬浮离心沉淀的细胞，取1 0 9 l 细胞悬液进行细胞计数。细胞浓度调整为l x l 0 5 个m l ，每孔按1 0 0 I r t l 细胞悬液接种到9 6 孔板内，每孔细胞即为1 1 0 4 个。细胞贴壁后，用含不同浓度G e n的D M E M 培养基换液，每个浓度
12、为3 复孔，继续培养2 4 7 2 h 。收集细胞前4 h ，每孔分别加入2 0 9 l ( 5 m g m 1 ) M T T ，继续培养4 h ，弃去培养液后每孔加入1 5 0 山D M S O 振荡1 0 m i n ，于博赛酶标仪波长5 7 0 n m 处测定吸光度O D 值，以每个浓度研究论文3 个复孔O D 值的平均值作为各浓度的平均O D 值。所有实验重复三次。根据下列公式计算不同浓度的G e n 对S W 4 8 0细胞的抑制率：抑制率= ( 1 实验组O D 值对照组O D 值) 1 0 0 ( 公式一)2 1 4 流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡取对数生长期的S W 4
13、 8 0 细胞，以l x1 0 6 瓶接种于2 5 m l培养瓶中，培养2 4 h 待细胞贴壁后，加入浓度分别为0 、2 0 、4 0 、8 0 9 9 m l 的G e n ，每个浓度为3 瓶，培养4 8 h 后，O 2 5胰酶消化细胞，1 0 0 0 r m i n ，5 m i n 离心收集细胞( 每组1 1 0 6 ) 。用P B S 溶液洗涤两次，7 0 乙醇( 4 V 预冷) 固定细胞，用R n a s e 酶消化。在4 。C 冰箱加入溴化丙啶( P I ) l m l染色3 0 m i n ，以5 0 0 目铜网过滤，制成合格的单细胞悬液以备上机检测。测定前，调整仪器的变异参数(
14、 C V ) 在2 以内，激发波长为4 8 8 m m 。采用流式细胞仪对细胞的D N A 进行定量分析，多参数细胞周期分析软件拟和处理，对样本进行细胞周期和凋亡率分析。2 1 5 光学显微镜观察细胞大体形态改变取对数生长期细胞制成单细胞悬液，以4 1 0 5 瓶接种于2 5 m l 培养瓶中，培养2 4 h 待细胞贴壁后，用含G e n4 0 9 9 m l的D M E M 培养基换液，继续培养4 8 h 后在倒置显微镜下观察细胞形态，并随机拍照。2 1 6 透射电镜观察细胞内部超微结构改变 将S W 4 8 0 细胞以4 X1 0 5 瓶接种于2 5 m l 培养瓶中，培养2 4 h 待细
15、胞贴壁后，用含G e n4 0 “g m l 的D M E M 培养基换液，对照组用等量的D M E M 培养基换液，继续培养4 8 h 后收集细胞。经2 5 戊二醛溶液前固定，1 锇酸后固定，逐研究论文级酒精脱水，树脂包埋，超薄切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色于透射电镜下观察细胞的超微结构变化。2 1 7 流式细胞术测定P C N A 、P 2 1 、V E G F 蛋白表达细胞收集同2 1 4 。用R n a s e 酶消化固定好的细胞，取单细胞悬液l m l ( 含细胞浓度1 1 0 6 m 1 ) ，加入P C N A 、P 2 1 、V E G F 鼠抗人单克隆抗体工作液各0 1
16、 m l ，室温孵育3 0 m i n ，加入P B S1 0 m l 洗涤后弃上清，再加入羊抗鼠F I T C I g G 二抗工作液1 0 0 山，避光室温孵育3 0 m i n ，加入P B S1 0 m l 离心后弃上清。上机前加入P B SO 1 m l ，5 0 0 目铜网过滤后用流式细胞仪检测这三种蛋白表达。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设P B S 代替一抗和二抗的阴性对照。按下列公式计算荧光指数( F I ) ：F I = 试验样品均道值x 寸照样品均道值均道值= l gm o d e 值x 3 4 0( 公式- - )2 2 体内实验2 2 1 动物分组体重为2 0 2 2 克健康雄性B A L B c 小N ( 6 0 只) 称重，采用随机数字法将小鼠随机分为5 组：对照组( 生理盐水) ；G e n低、中、高剂
