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1、分类号：U D C ：密级：重庆医科大学博士学位论文论文题目作者姓名m i c r o R N A 4 5 0 a 3 p 通过下调B u b l 基因抑制成纤维细 胞增殖并影响小鼠早期胚胎发育的机制研究罗敏指导教师姓名( 职称、单位名称)翁亚光教授重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室重庆市重点实验室申请学位级别博士学科、专业名称临床检验诊断学论文答辩年月2 0 1 3 年5 月2 0 1 3 年4 月嘲剃重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含
2、其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：呵凇日期：为号令。7学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内
3、容除外) ，并编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：丫冶支指导教师签名：煸亚麦曰期：妒限毕，7目录英汉缩略语名词对照1中文摘要3英文摘要10论文正文：mic r o R N A - 4 5 0 a - 3 p 通过下调B u b l 基因抑制成纤维细胞增殖并影响小鼠早期胚胎发育的机制研究1 7前言1 7第一部分mic r o R N A s 与B u b l 蛋白腺病毒过表达载体的构建和鉴定2 21 材料与方法2 22 实验结果3 83 讨论4 5参考文献4 8第二部分m ic r o R N A - 4 5 0 a - 3
4、p 靶向调控B u b l 基因抑制小鼠胚胎成纤维细胞增殖的机制研究5 01 材料与方法5 12 实验结果6 03 讨论7 1参考文献7 2第三部分显微注射mic r o R N A - 4 5 0 a - 3 p 对小鼠早期胚胎发育的影响7 61 材料与方法7 62 实验结果7 83 讨论8 1参考文献8 2全文小结8 5文献综述8 6致谢9 7博士在读期间发表的论文9 8重庆医科大学博士研究生学位论文英文缩写A dA m pb pB S AC C K 8c D N AC D SD E P Cd N l PD M S OE BE D T AF B SF C MF Q P C RG A P D
5、 HH C G i Sk bK DL B匝F Sm 浓N Am lm g英文全称英汉缩略语名词对照中文全称a d e n o v i r u s腺病毒A m p i c i l l i n氨苄青霉素b a s ep a i r碱基对B o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白C e l lC o u n t i n gK i t - 8细胞活力检测试剂盒c o m p l e m e n t a r yd e o x y n u c l e i ca c i d互补脱氧核糖核酸c o d i n gs e q u e n c e编码序列d i e t h y
6、lp y r o c a r b o n a t e焦碳酸- LJ 旨d e o x y n u c l e o s i d e st r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸盐D i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜E t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d乙二胺四乙酸f e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清f l o wc y t o m e t e r流式细胞术f l u
7、 o r e s c e n c e q u a n t i t yP C R实时荧光定量P C Rg l y s e r a l d e h y d e 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e3 磷酸甘油醛脱氢酶c h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n绒毛膜促性腺激素i m m o r t a l i z e dm o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s永生化的小鼠胚胎成纤维细胞k i l o - b a s ep a i rk i l o d
8、 a l t o nl u r i a - b e r t a n ic u l t u r em o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t sm i c r o R N Am i l l i l i t r em i l l i g r a m1千碱基对千道尔顿L B 培养基小鼠胚胎成纤维细胞微小R N A毫升毫克重庆医科大学博士研究生学位论文m R N Am u tO DO l i g oP B SP C RP A G Ep HP M S Gr p mR TR N AR N a s eS D Ss i R N AT r i sT E A 僵E
9、DT Em e s s a g er i b o n u c l e i ca c i dM u t a n t - t y p eo p t i c a ld e n s i t y信使核糖核酸突变型光密度o l i g o n u c l e o t i d e寡聚核苷酸p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯
10、酰胺凝胶电泳p o t e n t i a l o f h y d r o g e n酸碱度p r e g n a n tm a r eS e r U mg o n a d o t r o p i n孕马血清促性腺激素r o t a t i o n sp e rm i n u t er e v e r s et r a n s c r i p t i o nr i b o n u c l e i ca c i dr i b o n u c l e a s es o d i u md o d e c y ls u l f a t es m a l li n t e r f e r i n gR
11、N A转 分逆转录核糖核酸R N A 酶十二烷基磺酸钠小干扰R N At r i sh y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e三羟甲基氨基乙烷N ，N ，N ，N - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n eN ，N ，N ，N 四甲基乙二胺t r i s H C la n dE D T Ab u f f e rT r i s 盐酸乙二氨四乙酸缓冲液T w e e n 一2 0P o l y o x y e t h y l e n e - 2 0 S o r b i t a nm o
12、 n o l a u t a t e吐温- - 2 0U lu gW Tm i c r o l i t r em i c r o g r a mw i l d t y p e2微升微克野生型重庆医科大学博士研究生学位论文m ic r o R N A - 4 5 0 a - 3 p 通过下调B u bl 基因抑制成纤维细胞增殖并影响小鼠早期胚胎发育的机制研究1摘要胚胎的早期发育中，受精卵的正常分裂是胚胎发育的关键环节。受精卵在早期进行着旺盛的有丝分裂，其染色体能够正确分离到后代的两个子细胞中是有丝分裂正常的重要基础。染色体如果发生异常分离，有可能出现染色体数目异常、染色体不稳定性，进而影响细胞的
13、生长周期，导致细胞周期的延迟甚至停止。为了确保分离的准确性，在真核生物细胞的整个分裂过程中，存在一个监护网络即纺锤体组装检查点，它对D N A 的损伤、纺锤丝的完整性及染色体最终是否正常分离起着重要的监控作用。纺锤体组装检查点在行使检查点功能时关卡蛋白起了非常重要的作用，其中B u b l 是其最主要的组件蛋白之一。它作为监控机制的“感受器蛋白”，对细胞的增殖、分化等过程的影响是可以肯定的。本课题组在前期实验中应用I A i 技术特异性抑制h B u b l基因的表达，发现h B u b l 水平下调后导致胚胎细胞不同程度的染色体异常。同时对数十例自然流产胚胎组织的检测结果发现，h B u b
14、 l 基因表达的蛋白水平均明显低于正常或缺失。但在此过程中B u b l 本身的表达是如何被调控的尚不清楚。新近发现m i c r o R N A ( m i R N A ) 是真核细1 基金项目：国家自然科学基金资助( 3 0 8 7 2 7 7 0 )3重庆医科大学博士研究生学位论文胞中一大类参与基因转录后调控的非编码小分子R N A ，与胚胎发育、干细胞分化等有关。本课题组已经证实在自然流产胚胎中B u b l 蛋白表达水平明显低于正常组织中，而其m R N A 水平却无明显变化，提示有可能存在m i R N A 这种转录后调控机制。通过生物信息学网上预测软件分析，m i R N A 一
15、3 0 a 、3 0 e 、4 9 4 、4 6 7 a 、4 6 7 e 、4 5 0 a 一3 p 、4 6 6 a - 3 p 和2 9 7 b有可能调控B u b l 蛋白。本课题将( 1 ) 利用重组腺病毒或者m i R N A 模拟体体外探讨B u b l 蛋白是否确实存在转录后调控机制及其对小鼠成纤维细胞的增殖，凋亡和周期的影响。( 2 ) 通过受精卵显微注射过表达m i R N A s 下调B u b l 表达观察对胚胎发育的影响。阐明m i R N A s 对胚胎细胞分裂的调控作用和相应机制，可为提高妊娠质量和防治胚胎异常流产提供思路。第一部分m i c r o R N A s 与B u b l 蛋白腺病毒过表达载体的构建和鉴定目的：1 、构建m i R N A 3
