《MICAB基因多态性与血吸虫病和白血病相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《MICAB基因多态性与血吸虫病和白血病相关性研究（132页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号U D C博十学位论文密级M I C A B 基因多态性与血吸虫病和白血病相关性研究S t u d yo nr e l a t i o n s h i pb e t w e e nM I C A Bg e n e t i cp o l y m o r p h i s ma n ds c h i s t o s o m i a s i s l e u k e m i a作者姓名： 学科专业： 院、系( 所) ： 指导教师： 吾I j 指导教师龚拯 医学免疫学 基础医学院 余平教授 汪世平教授论文答辩日期垄! 垄坚1 2 咀答辩委员会主中南大学 2 0 1 2 年lO 月原创性声明本人声明，
2、所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其它单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：垄超日期：坐年且月- 三细学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位
3、论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：垄超导师签名E t g 目- 盔! ! 之年月丛日博士学位论文摘要摘要一研究目的 1 研究M I C A B 在湖南北部汉族人群中的分布特点。2 分析M I C A B 等位基因的多态性与血吸虫病易感性和肝纤维化的相关性。3 分析M I C A B 等位基因的多态性与白血病易感的相关性。 二研究方法 采用世界卫生组织( W H 0 ) 推荐的标准盐析法从样本新鲜血液 中提取基因组D N A 。采用P C R - S S P 及P C R - S B T 两种方法对所得D N A进行等位基因分型。分析M I C A B
4、 等位基因频率、单倍型频率以及 加C A B 多态性与血吸虫病、白血病的相关性。 三实验结果 1 湖南北部汉族人群M I C A B 基因多态性研究在湖南北部汉族人群中共检测到1 1 个M I C A 等位基因，频率最高的依次为M I C A * 0 1 0 ( 2 8 9 5 、) 、M I C A * 0 0 8 0 1 ( 2 0 5 3 ) 和 M I C A * 0 0 2 ：0 1 ( 1 5 7 9 ) ；共检测到5 种S T R 型别，其中M I C A * A 5 ( 3 7 8 9 ) 和M I C A 木A 5 1 ( 2 1 0 5 ) 频率最高，M I C A * A
5、 6 ( 7 3 7 )频率最低。 在湖南北部汉族人群中共检测到1 0 个M I C B 等位基因，以 M C B 木0 0 5 ：0 2 O l O 最常见( 5 8 4 2 ) ，其他较常见的等位基因有M I C B * 0 0 2 ：0 1 ( 1 0 0 0 ) 、M I C B * 0 0 8( 7 8 9 ) ，最少见的是M I C B 枣0 1 2 ( 0 5 3 ) 和M I C B 宰0 1 9 ( 0 5 3 ) 。 将M I C A B 基因在湖南北部汉族人群中的分布与该基因在其他 人群( 中国广东汉族人、中国北方汉族人、中国浙江汉族人、朝鲜人、 日本人、泰国人以及西班牙
6、人) 中的分布进行比较，显示M I C A B基因的分布在不同人群之间存在差异。湖南北部汉族人群有自己独特的分布特征。 在湖南北部汉族人群中，M I C A * 0 0 4 M I C B * 0 0 4 ：0 1 与 M I C A * 0 1 0 C B 木0 0 5 ：0 2 0 1 0 具有显著的连锁不平衡。 2 。M I C A B 等位基因多态性与血吸虫病相关性研究本研究比较了正常健康对照组与血吸虫病感染组、血吸虫病性重 度肝纤维化病人组和轻度肝纤维化病人组中M I C A B 基因的多态性。在血吸虫感染组与健康对照组中共发现13 种M I C A 等位基因和博士学位论文摘要5 种
7、M C A S T R 基因型，C A * 0 1 2 ：0 1 ( 11 5 8 V S5 8 3 ) 、M I C A * 0 1 7 ( 2 11 V SO o o ) 及M I C A * 0 2 7 ( 3 1 6 V SO 9 7 ) 在对照人 群组较血吸虫病人组中分布频率较高，但P c 值显示没有统计学意义( P c 0 0 5 ) 。M I C A S T R 型别分析显示，M I C A S T R 与血吸虫病易感没 有相关性，但M I C A * A 5 基因型的分布频率在重度肝纤维化组显著高于轻度肝纤维化组( 4 5 10 V S2 6 9 2 ，P c O 0 5 )
8、C A 水A 5a l l e l ef r e q u e n c yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri na d v a n c e dl i v e rf i b r o s i sg r o u p st h a ns l i g h tl i v e rf i b r o s i sg r o u p s ( P c ( P C R 缓冲液( R o c h e 公司) ；d N T P 混合液( A m e r s h a mB i o s c i e n c e 公司) ：D N A 标准分子量M a r k e r ( 康为世纪
9、) ；无核酸酶的纯净水( S i g m a ) ；琼脂糖粉( G e n e C h o i c e ) ；溴化乙锭；l x T B E 电泳缓冲液；E x o n u c l e a s eI ( U S B ) ；S h r i m pA l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( U S B ) 。测序反应试剂：B i g D y ev 3 1 试剂盒( A p p l i e dB i o s y s t e m s ) ；D M S O ( S i g m a ) ；2 S D S ：M l x l t i s c r e e nH V 加过滤膜( M
10、 i l l i p o r e ) ；S e p h a d e x ( S i g m a ) ；M i c r o A m p9 6 孔反应板( 测序仪专用A p p l i e dB i o s y s t e m s ) 。3 1 3 0 X 1 基因测序仪( A p p l i e dB i o s y s t e m s ) 。M I C A 分型分析软件：M I C AS B TS o f t w a r e 软件( 由美国德克萨斯西南医学中心邹义洲教授提供) 。1 1 5 2P C R 全长扩增反应体系基因组D N A1 0 0 n g ；I P C R 缓冲液；1 0u M
11、 的正反方向引物；2 0 0 u Md N T P s ：D N A 扩增聚合酶2 单位，加无核酸酶的双蒸水至2 0 “l 总体积。P C R 反应条件9 6 0 C 预变性2 m i n ；9 6 0 C 变性3 0 s ，6 9 0 C 退火8 0 s ，7 2 0 C 延伸9 0 s ，1 0 个循环；9 6 0 C 变性3 0 s ，6 7 0 C 退火8 0 s ，7 2 0 C 延伸9 0 s ，2 0 个循环；7 2 延伸1 0 m i n ，于4 0 c保存。1 1 5 3 琼脂糖电泳确定M I C A 扩增效果取3 山P C R 产物混合3 山电泳加样缓冲液于1 0 琼脂糖电
12、泳，恒压1 0 0 V 电泳2 0m i n 后于紫外光下观察电泳条带，M I C A 的P C R 产物出现的片段大小在2 2 0 0 b p 左右。拍照保存记录。1 1 5 4P C R 产物的测序前处理1 4博士学位论文第一章湖南北部汉族人群M I C A B 基因多态性研究向P C R 产物溶液中加入3 6 9 l 的E x o I S A P 酶在3 7 0 C 孵育3 0 m i n ，再置8 0 0 C作用1 5 m i n 灭活所有酶活性。其目的是为了清除P C R 反应体系中引物、d N T P s和扩增酶的活性等成分。1 1 5 5 测序前P C R 反应对每个D N A
13、样都要进行4 次不同的测序反应，反应引物和测序范围如图1 5所示，每次测序反应的总体积为1 5 山。其成份为：纯化的P C R 产物2 0 9 l ；测序混合液5 0 9 h 引物1 0 p m o l g l2 0 “1 ；无核酸酶的水6 0g l ，混匀，低温离心除去气泡。测序反应的循环条件：9 6 0 C 预变性l m i n ；9 6 0 C 变性1 0 s ，5 0 0 C 退火5 s ，6 0 0 C 延伸1 2 0 s ，共2 5 个循环；置4 0 C 保存。1 1 5 6 测序上机前处理待测序反应完成后向测序反应孔内加入1 5 山的2 S D S 使D N A 变性，反应条件：
14、9 5 0 C ，5 分钟，置2 2 0 C 待纯化。取水化S e p h a d e x 板在2 1 0 0 r m i n ，室温离心3 m i n ，另外准备基因测序板向其中预加入每孔1 0 “1 无核酸酶纯净水。用多孔加样枪将测序反应液( 1 5 9 1 ) 转移至对应的S e p h a d e x 板中孔中，2 1 0 0 r m i n ，室温离心3 m i n ，使测序反应液径S e p h a d e x 层过滤至基因测序板的孔中，上机测序。1 1 5 7 资料分析每一样本进行4 个反应的基因测序，基因测序仪获得的测序结果自动生成电子文件为木A b l 格式，其结果分别存为4
15、 个文件。1 F 和2 R 引物序列反应产生的两个序列文件为包括外显子2 和外显子3 序列在内的正反两个方向序列文件。3 F和4 R 序列反应产生的另外两个序列文件为包括外显子4 和T M 序列( 外显子5 )正反方向的D N A 序列文件。如果来自两条染色体T Mq b ( G C T ) n 重复序列数不一致，T M 序列的测序信号就会出现双波型。该双波型的复合信号能通过M I C AS B T 软件经电子计算机特定的算法实现T M 信号分离。目前已经发现在T M 微卫星型别有7 种。由于第四内含子存在( T ) 7 或( T ) 8 不等的重复序列，使得上游引物3 F 的测序信号在第四内
16、含子内就会出现双信号波形，但从反方向测序的信号能较好的反应T M 的多态性序列的复合信号。因此通常我们应用4 R 测序引物来进行T M 序列的测序，而且实践中单独使用4 R 测序引物就能对T M 区进行M I C A S T R 分型。如表1 6 列出了编码链5 3 微卫星区域的碱基序列。1 1 6P C R S S P 方法对M I C B 基因分型1 1 6 1P C R 引物设计P C R S S P 方法是针对M I C B 基因多态位点，预先设计出一整套等位基因组特异性引物( s e q u e n c es p e c i f i cp r i m e r , S S P ) ，借助P C R 技术获得M I C B 型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定M I C B 型别。分型所用引物参考文献博士学位论文第一章湖南
