《杂合抗菌肽LFM3的分子设计及其在毕赤酵母中的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《杂合抗菌肽LFM3的分子设计及其在毕赤酵母中的表达（75页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、M O L E C U L A RD E S I G HO FT H EH Y B 时D_ _ _ _ _ !A N T I M I C R O B I A LP E P T I D EO FL F M 3A N DI T SE X P R E SS I O NI NP i c h i ap a s t o r i sB yL i a oX u e w e nS u p e r v i s o r ：P r o f D r F a nS h e n g c h a oP r o f D r Y a oH u o c h u nAD i s s e r t a t i o nS u b m i
2、t t e dt oN a n ji n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yI np a r t i a lF u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sF o rt h eM a s t e rD e g r e eo f A g r o n o m y 一一-C o m p l e t e di nJ u n e2 012C o m m e n c e m e n ti nJ u n e2 012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取
3、得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文胤需黝虢私挑学位论文版权使用授权书年乞A 哆B本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。( 请在以上方框内打
4、“”) 一靴敝储儒麓渣各皆导师( 需亲笔) 签名：切厂乙年 L F M 3 L F M 4 L F M 6 L F M 2 L F M 5 ；从平均疏水力矩( H ) 上看，L F M 3 L F M 2 L F M I L F M 一6 L F M 5 L F M 一4 。一般来说，正电荷数越多，带正电荷的抗菌肽与带负电的细胞膜之间的静电作用力就越大，抗菌效果就越好；相对疏水力矩( 1 aH r e l ) 是肽的疏水力矩与理想两亲肽的疏水力矩的相对值，抗菌肽的相对疏水力矩越大，两亲性越好，抗菌活性越好且对真核细胞的溶血性越低；抗菌肽的平均疏水力矩越大，与细胞膜的疏水相互作用力就越大，抗菌作
5、用就越强。通过平均疏水力矩、相对疏水力矩与净正电荷数三个参数综合分析，初步得出L F M 一3 作为目标杂合抗菌肽具有综合优势。2 2 杂合抗菌肽二级结构预测目前，许多二级结构预测的算法都是基于序列比对，通过序列比对计算出目标序列中每个氨基酸的保守程度。对于二级结构三态( 0 【，p ，n o n e ) 预测准确率首先达到7 0 的方法是基于统计的神经网络方法( P H D s e c ) 。神经网络方法利用通过多重序列比对得到的进化信息作为神经网络的输入，另外采用了一个全局的描述子，即所有氨基酸组成( 2 0 种氨基酸中每个所占的比例) 作为蛋第三章杂合抗菌肽的分子设计与合成白质序列的全局
6、信息。这类算法预测的准确率能达到7 0 至7 5 t 6 1 。各种方法预测的准确率随蛋白质类型的不同而变化。例如，一种预测方法在某些情况下预测的准确率能够达到9 0 ，而在最差的情况下仅达到5 0 ，甚至更低。在实际应用中究竟使用那种方法，还需根据具体的情况。虽然二级结构预测的准确性有待提高，其预测结果仍然能提供许多结构信息，尤其是当一个蛋白质的真实结构尚未解出时更是如此。通过对多种方法预测结果的综合分析，再结合实验数据，往往可以提高预测的准确度。由英国邓迪大学开发的J p r e d 在线服务器，整合了被称为J n e t 的神经网络方法，专门用来预测蛋白质的二级结构，是目前最优秀的蛋白预
7、测服务器之一。使用J p r e d 对杂合抗菌肽的二级结构预测结果如表2 1 所示。由表3 1 可见，除母体肽M a g a i n i n 2 与杂合肽L F M 一6 外，杂合抗菌肽L F M 3的0 【一螺旋率最高，为5 0 。对于a 螺旋型线性抗菌肽而言，一般认为提高抗菌肽的螺旋度，可以提高抗菌肽对细胞膜的亲和力，从而提高抗菌力【_ 7 1 。2 3 杂合抗菌肽的两亲性和电荷分布预测两亲性是指沿螺旋轴平行的两个侧面，一侧亲水残基集中，显亲水性；另外一侧疏水残基较多，显疏水性。两亲性使得螺旋的侧面上形成了疏水力矩( h y d r o p h o b i cm o m e n t )
8、，并与0 【一螺旋在N 端和C 端形成的电荷偶极一起，对抗菌肽活性起关键作用。蛋白序列分析软件包A N T H E P R O T5 0 ，包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能强大，能进行各种蛋白序列分析与特性预测，包括：蛋白序列二级结构预测；绘制出蛋白序列的所有理化特性曲线；可以选定一个片段绘制H e l i c a lW h e e l 图；进行点阵图( D o tP l o t ) 分析；计算信号肽潜在的断裂位点等功能。本实验使用该软件做H e l i c a lW h e e l 图，分析杂合抗菌肽的两亲性特征和电荷分布特征。利用蛋白序列分析软件A N T H E P R O
9、T5 0 绘制杂合抗菌肽的螺旋轮图谱如表3 - 2 所示。只有L F M _ 1 与L F M _ 3 的疏水性氨基酸残基和亲水性氨基酸残基大体均匀分布在螺旋的两侧，其余四条杂合肽的疏水性氨基酸残基和亲水性氨基酸残基分布较为混杂。说明L F M 1 与L F M 3 的两亲性较好，有利于赋予杂合抗菌肽抗菌活性，同时保持低溶血性或无溶血性。通过对设计的抗菌肽理化性质、二级结构、电荷分布等三个方面的预测综合推断：杂合肽L F M 3 的结构符合膜结合型抗菌肽的一般结构特征，具有开发抗菌肽的综合优势。为了进一步验证六条杂合肽的活性关系并缩短研究时间，将六条杂合肽的的氨基酸序列送交吉尔生化( 上海)
10、有限公司合成。杂合抗菌肽L F M 3 的分子设计及其在毕赤酵母中的表达H ：d 一螺旋；E ：1 3 折叠：C ：无规卷曲：无法预测( H ：a l p h a h e Ii X ：E ：e x t e n ds t r a n d ：0 - ：r a n d o mC O iI ：一：n op r e d i c t i o n )2 4 合成抗菌肽最小抑菌浓度测定结果选择金黄色葡萄球菌C o w a nI 与大肠杆菌K 8 8 为测试菌，测定合成抗菌肽的最小抑菌浓度，利用微量肉汤稀释法测定结果如表3 3 所示。除杂合肽L F M 4没有检测到抑菌活性外，其均余检测到抑菌活性，活性顺序依次
11、是：L F M 3 L F M 2 L F M 5 L F M 6 L F M 1 。由表3 3 还可发现，合成肽对金黄色葡萄球菌M I C 均为对大肠杆菌M I C 的一半，可见，合成抗菌肽对革兰阳性的金黄色葡萄球菌的抑菌活性比对革兰阴性的大肠杆菌的抑菌活性要高一倍。L F M 3 的抗菌活性在六条杂合肽中最高，与预期相一致。表3 - 3 合成抗菌肽L F M 对金葡菌与大肠杆菌的MICT a b I e3 - 3M I o fA n t i m i c r o b i a IP e p t i d e so fL F M sf o r S ，a u r e u sa n dE C O I
12、i杂合肽丛! 竺( 世)金黄色葡萄球菌C o w a nI大肠杆菌K 8 8S- aedtpep一芝级t二计而的n丽肽o磊菌吐爱抗出互薰涮 肌 一= 一i| | | 2一心 一bi训 一第三章杂合抗菌肽的分子设计与合成图2 1 六条杂合肽的螺旋轮图疏水性、亲水性和其他氨基酸( 甘氨酸) 分别以蓝色、红色、灰色表示，绿色表示：酸F i g 2 1H e Ii c a lw h e e Ip r o j e c t i o n so ft h eS i Xh y b ri dp e p t i d e sH y d r o p h o b i C h y d r o p h iIi Ca n do
13、 t h e rr e s i d u e s ( G I y c i n e ) s h o w ni nb I u e r e da n Ir e s p e c t i v e I Y ：C y s t e i n ei ng r e e n2 5 合成抗菌肽L F M - 3 溶血活性测定结果许多天然抗菌肽都有溶血性，溶血活性是抗菌肽开发应用中需要考扁3 l杂合抗菌肽L F M 3 的分子设计及其在毕赤酵母中的表达要不利因素，提高抗菌肽的抗茵活性而降低或消除抗菌肽的溶血活性，是设计开发杂合抗菌肽的趋势所在。本实验利用鸡血红细胞测定了合成肽L F M 3 的溶血活性，结果如表3 4 所示
14、，溶血结果显示，当合成肽L F M 3 的浓度小于或等于6 4 1 t g m L 时，对鸡血红细胞没有溶血性：当合成肽L F M 3 的浓度大于或等于1 2 8 蚓m L 时，对鸡血红细胞有着微弱的溶血性，但最高不超过7 2 8 。可见，合成肽的溶血活性在浓度为6 4 1 a g m L 与1 2 8 p g m L 之间有一个跃升，推测可能是抗菌肽的溶血作用有个浓度阈值，只有超过这个阈值才显示溶血活性。另外，在达到溶血阈值之后，随着合成肽浓度的增加，对鸡血红细胞溶血率随之升高，但增幅很小。表3 - 4 不同浓度合成肽L F I I - 3 对鸡血细胞的溶血率T a b I e3 - 4H
15、e m I y s iSr a t eo fc h i c k e nb I o o de r y t h r o c y t ea td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fIF M - 3合成肽L F M 浓度1 6 03 2 06 4 01 2 8 02 5 6 051 2 01 0 2 4 0；盟! ! ! 兰； 溶血率( ) 0005 8 26 6 57 0 37 2 8旦皇里旦! 芝! i ! 堕曼! 丝13 讨论抗菌肽自身为氨基酸组成，抗菌机制又不同于传统的抗生素，具有广阔的应用前景，然而天然抗菌肽并非完美无缺，与抗生素相比，
16、抗菌活性不够理想、抗菌谱相对较窄、合成成本较高、部分对病原微生物有杀灭活性的同时对真核细胞存在溶血作用【8 】。最大限度地提高活性、降低毒性和成本，是杂合抗菌肽开发的首要努力方向。对抗菌肽分子进行设计与改造，开发出高抗菌活性低溶血性的抗菌肽意义重大。要对抗菌肽进行分子设计与改造，首先就应该了解抗茵肽的结构与功能的关系。抗菌肽的结构参数如螺旋程度、净电荷数、疏水性、两亲性等与抗菌肽的攻膜活性相关，而抗菌肽的两亲性对抗菌肽的活性起关键作用【9 】。截止到2 0 11年9 月1 0 日，一共有1 7 9 0 种抗菌肽上传到A P D 数据库，除开未知三维结构的抗菌肽，a 螺旋型抗菌肽几乎是其他种类之和，可见0 c 螺旋型抗菌肽在抗菌肽家族中占有极其重要的地位。0 【螺旋型抗菌肽结构简单，抗菌机理较为明确，最便于进行分子设计。对a 螺旋型抗菌肽而
