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1、中国医科大学博士学位论文甘氨酸在出血性休克大白鼠中的作用姓名：王钢申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：王恩华2003.1.1甘氨酸在出血性休克大白鼠中的作用摘要实验目的：观察甘氨酸是否对出血性休克所致的脏器损伤具有保护作用以及能否降低死亡率，同时阐明其机制。实验方法：1 失血性休克模型的建立：W i s t e r 大鼠( 体重2 5 0 3 0 0 9 ) 雌雄不限，用4 5 异戊巴比妥( 8 0 m g k g ) 在2 5 室温下腹腔内给药麻醉。右股动脉插入套管针，连接低压分析仪，监测血压；左颈静脉插管给予甘氨酸、生理盐水和自体血( 复苏通路) ；右颈动脉插管，另一端连接
2、肝素化玻璃注射器中，进行放血诱导休克，在5 分钟内使血压下降并维持平均动脉压3 0 3 5 m m H g 。通过输、抽少量血维持低血压状态5 5 分钟。低血压6 0 分钟后用6 0 自体血回输5 分钟和2倍回输血量的生理盐水回输5 5 分钟进行复苏“”。复苏前大白鼠随机分为三组，每组2 0 只：休克组( S h o c k ) 、甘氨酸治疗组( G l y ci n e + S h o c k ) 和假休克组( s h a m ) ( 只进行手术操作不放血诱导休克) 。甘氨酸6 0 m g k g 溶于0 5 m l 生理盐水中在复苏开始时输入左颈静脉，相同体积的生理盐水给予休克组。2 c
3、r ，C KA S T ，A L T 和A l 。K P检测：分别于休克前，休克终末，复苏终末及复苏后1 8 小时采集血样，血清离心，检测肌酐( c r ) ，肌酸磷酸激酶( c K ) ，谷草转氨酶( A S T ) ，谷丙转氨酶( A L T ) 和碱性磷酸酶( A L K P ) 。3 肝脏K u p f f e r 细胞的分离和培养：复苏后2 小时，肝脏在活体时经门静脉插管，用无C a 2 + 无M 9 2 +H a n k s 平衡盐溶液( H B S S ) 在3 7 下进行灌流( 以2 0 m l 分钟灌流1 0 分钟) ，随后用含有0 0 2 5 I V 型胶原酶的H a n
4、k s 溶液在3 7 F以2 3 m 1 分的速度灌流7 分钟，当肝脏被充分消化后，取下放入I V 型胶原酶缓冲液中并切成小碎块，3 7 水浴振荡5 分钟，悬浮液用1 5 0日网过滤，然后在4 以5 0 * g 离心l o 分钟，除去下层细胞团块，上层液加入2 5 + 5 0 P e r c o l l 梯度介质中在4 8 0 0 * g 离心1 0 分钟，抽取2 5 与5 0 界面之间细胞平板片状团块，用H a n k s 液冲洗再离心，细胞移入培养液中，放入3 7 “ C5 C O 。孵育箱中孵育l 小时，非贴壁的卜皮细胞通过换液除去而贴壁细胞为k u p f f e r 细胞。细胞培养2
5、 4 小时后做 c a 2 + i 和T N F Q 检测。4 细胞内钙( C a “ i ) 测定：使用荧光钙指示剂F u r a 2 和荧光显微镜进行检测。含有k u p f f e r 细胞的培养眦在3 7 下用1 1 0 0 0 n g m l 内毒素( L f ) s ) 刺激，在3 4 0 和3 8 0 h m 激发波长和5l O n m 的发射波长检测显微镜视野下每个k u p f f e r 细胞F u r a 一2荧光密度的变化。细胞内钙浓度由以下公式来确定： c 岔_ i- K d ( R - R m i n ) ( R m a x R ) ( F o F s ) 。5 在
6、特定介质中从培养的k u p f f e r 细胞测定T N F - ：游离的K u p f f e r 细胞种植在含有培养液的2 4 孔板中培养。2 4 小时后K u p f f e r 细胞在含有卜1 0 0 0 n g m L 的L P S 、5 鼠血清、1 0 m MH E P E S 和抗生素的R P M I1 6 4 0 液体中刺激4 小时。 二层清液用酶联免疫吸附测定法检测T N F Q ( E L I S A ) 。6 病理组织学观察：复苏后1 8 小时取大白鼠肺、心、肝和肾脏。用1 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，H - E 染色，光镜观察组织病理变化。7 统计学分析：使用S
7、P S Sl l 。0 版本分析软件，应用方差、卡方和t 检验。实验结果：1 失血性休克后大白鼠的生存率：甘氨酸治疗组生存瞿现出甘氨酸剂量依赖性。本实验对甘氨酸剂量对生存率影响实验观察7 2 小时，结果得出最大生存率为7 7 8 ，剂量大约为6 0 m g k g 。休克组1 0 只大鼠接受生理盐水，1 8 小时生存率为7 0 ，2 4 小时生存率为f i 0 ，4 8 小时生存率为3 0 ，7 2 小时为2 0 9 6 。甘氨酸治疗组( 9 只) ，1 8小时生存率1 0 0 ，2 4 小时8 8 9 ，4 8 小时7 7 8 ，7 2 小时7 7 8 。7 2 小时两组生存率经卡方( C
8、h i s q u a r e ) 检验，差异显著( P 0 0 5 ，两组无差异。复苏后1 8 小时生化指标休克组( 1 0 )假休克鲴( 1 0 )正常对照组( 1 0 ) t 检验( P 值)C r* 2 3 0O 士8 683 5 士284 l6 士1 0 5 0 0 5 两组无差异。4 出血性休克后大白鼠脏器损害病理组织形态学改变复苏后1 8 小时分别取休克组和假休克组大白鼠的肺、心、肝和肾脏器，中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规H - E 染色。在假休克组，没有明显病理性变化，与正常组织无明显差异；在休克组，肺组织中町见明显的肺泡壁增厚，上皮增生，毛细血管扩张充血，肺泡壁间质细胞增生
9、，巨噬细胞增多，毛细血管周围淋巴细胞，浆细胞侵润，形成血管套样改变：在心肌组织中，休克组呈现心肌细胞水肿，有中度、重度变性等；肝组织病理，休克组肝细胞肿大变性，水肿，肝窦变窄：休克组肾组织中近曲小管广泛水肿变性，管腔变窄，炎性细胞侵润( 图片2 ，3 ，4 ，5 ) 。以上病理变化提示多脏器 现炎症反应，经历s I R S 过程。附论文图片嗣片l多导生理记录仪记录休克组大自鼠在诱导休克至复苏的血压变化肺脏假休克组休克组图片2 复苏后1 8 小时，休克组和假休克组肺脏的病理组织切片比较( H - E 染色，2 0 0 倍)肾脏假休克组休克组| 冬I 片3 复苏后1 8 小时，休克组和假休克组肾脏
10、的病理组织切片比较( I - I E 染色，2 0 0 倍)肝脏假休克组休克组图片4 复苏后1 8 小时，休克组和假休克组肝脏的病理组织切片比较( H E 染色，2 0 0 倍)1 7心脏假休克组休克组图片5 复苏后1 8 小时，休克组和假休克组心脏的病理绢织切片比较( H E 染色2 0 0 倍)讨论缺血再灌注损伤和细菌内毒素刺激可诱发休克大鼠多脏器功能障碍的病理生理过程。失血性休克以及输I f 【L 、补液等进行复苏治疗即导致机体出现缺血一再灌注损伤。重要的足，组织细胞损伤不是发生卉：缺血期而是在再灌注复苏期，它町诱发氧应激反应( o x y g e ns t r e s s )、产生N
11、O 、过氧化亚硝酸盐等超氧化物，一方面可对组织细胞起到直接毒性作用，更重要的是，触发炎症反应即出现整个炎症反应过程( S I R s ) “”，进而引发多脏器功能不全( M O D S ) 的病理过程，并导致高死亡率“。本实验结果显示：1 ) 休克复苏后1 8 小时大自鼠死亡率开始生商，7 2 小时高达8 0 ；2 ) 反映心肌、骨骼肌、肝脏和肾脏功能损害指标C K ，C r , A S T , A L T 和A L K P 复苏后1 8 小时均明显高于假休克组和正常大白鼠生化指标，达3 5 倍；提示多脏器功能障碍( M O D S ) 。3 ，) 心、肺、肝和肾脏病理组织切片显示均有程度不同
12、的间质水肿、细胞变性、炎性细胞浸润等病理改变，进步说明多脏器炎症反应过程和多脏器功能障碍的出现噶“。本实验成功地制造出血性休克的动物模型，进行复苏引发缺咖一再灌注损伤并模拟临床多脏器功能不全发生的过程。目前关于多脏器功能不全以及晚期高的死亡率有许多假说，但比较一致和认同的是“双相预激和炎症失控”假说，前者认为最早的创伤，休克等致伤因素可被视为第一次打击。在此期，各种免疫细胞及多种炎症介质参与炎症反应，但程度有限，最重要的是，炎症细胞被激活处于一种“预激发状态( p r e p r i m e d ) 。虽然它可以造成直接器官损伤，但第一次打击并不是真正意义上的M O O S 。但其引起的炎症细
13、胞活化，内皮细胞和实质细胞损伤，凋亡，坏死组织存留，肠道粘膜屏障损害，细菌内毒素入血，能为全身炎症反应提供持续的刺激，值得一提的是，肠道粘膜屏障破坏和细菌群移位，内毒素入血( 主要成分L P S ) 被认为是第二次打。占的重要因素之“。第二次打击时期一个非常突出的特点是炎症和J 嘲敫反应具有放大效应，即使打击程度巧i 如第一次打击也能造成处j 二激发状态的炎症细胞更为剧烈的反应，从m j 超量地释放细胞因子和炎性介质同时它们作用于靶细胞町以导致二级，i 级甚至更多级的新的介质的产生形成炎症介质瀑布样反应( c a s c a d e ) ，这种失控的炎症反应刁i 断发展直至导致组织细胞损伤和器
14、官功能障碍( M O D S ) “1 。结论本实验得出以下结论：模拟临床休克致病因素一出血性休克一成功建立多脏器功能障碍的大白鼠模型。为研究M O I ) S 病理生理、发病机制和研究预防治疗以及临床应用提供有效实验室研究方法。参考文献1 盛志勇，胡森主编多器官功能障碍综合征第1 版，北京：科学出版社1 9 9 9 ；1 8 6 12 C s a b aS z a b oa n dT i m o t h yR B i l l i a r ：N o v e lR o l e so fN i t r i cO x i d ei nH e m o r r h a g eS h o c k S h
15、o c k ，V 0 1 1 2 ，N o 1 ，p l 一9 ，1 9 9 93 A b e l l oP B u c h m a nT G ，B u l k l e yG B ：S h o c ka n dm u l t i p l eo r g a nf a i l u r e A d vE x pM e dB i o l3 6 6 ：2 5 3 - 2 6 8 ，1 9 9 4 4 C a r r i c oC J ，M e a k i n s 几，M a r s h a l lJ C ，F r yD ，M a i e rR V ：M u l t i p l e o r g a nf
16、a i l u r es y n d r o m e A r c h 肌曙1 2 1 ：1 9 6 2 0 8 ，1 9 8 6 5 J o h nM e n e z e s ，C h r i s t i a nH i e r h o l z e r , S i m o nC W a t k i n se t c ：An o v e ln i t r i co x i d es c a v e n g e rd e c r e a s e sl i v e ri n ju r ya n di m p r o v e ss u r v i v a la f t e rh e m o r r h a g i cs h o c k A m J P h y s i 0 1 2 7 7 ( G a s t r o i n t e s t
