《BL21DE3重组工程体系的建立和自剪切系统的探索》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BL21DE3重组工程体系的建立和自剪切系统的探索（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构己经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：石杠书目期：f 乡夕t y 7，学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸
2、质文档，允许论文被查阅和借阅。( 保密论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：! 匹盐保 密期限为年。学位论文作者签名：石p 俞指导教师签名：日期：如f 占。r y )日期：目录目录目录1 名词简写I V 摘要v A b s t r a c t V I I 第一章综述1 1 重组工程1 1 1 重组简介11 1 1R a c 噬菌体编码的R e c E T 重组系统l 1 1 2 来源于九噬菌体的R e d 重组系统11 2R e d 重组系统介导的质粒修饰21 3R e d 重组介导染色体上基因的修饰32T E V 蛋白酶52 1T E V 蛋白酶简介52 2T
3、E v 蛋白酶的应用6 第二章B L 2 1 ( D E 3 ) 重组体系的建立8 第一节B L 2 1 ( D E 3 ) 基因组上基因敲除的验证8 1 实验材料8 1 1 菌种和质粒8 1 2 引物合成和测序8 1 3 培养基和缓冲液的配制9 1 4 主要工具酶和化学试剂1 0 1 5 实验仪器设备及来源1 0 2 实验方法1 0 2 1 常规的分子生物学操作方法1 0 2 1 1 制备大肠杆菌D H I O B 电转化感受态细胞及转化D N A 1 02 1 2P C R 方法扩增目的片段1 1 2 1 3 常用的P C R 反应条件1 1 2 1 4 菌落P E R 1 1 2 1 5
4、 酶切反应1 2 2 1 6 目的D N A 片段的回收1 22 1 7D N A 连接反应1 2 2 1 8 质粒提取1 2 2 2 重组酶表达质粒1 3 2 3 诱导重组酶表达的电转感受态的制备1 3 2 4 同源重组介导将H A - S n e o S H A 融合到B L 2 1 ( D E 3 ) 基因组中1 4 3 实验结果1 4 3 1 重组片段的扩增1 4 3 2 敲除结果验证1 5 4 小结1 6 第二节B L 2 1 ( D E 3 ) b s d R 的敲除及效率验证1 6 1 实验材料1 6目录1 1 菌种和质粒1 6 1 2 培养基和缓冲液的配制1 8 1 3 主要工
5、具酶及化学试剂1 8 1 4 主要仪器设备及来源1 8 1 5 引物合成与测序1 8 2 实验方法1 9 2 1 常规分子生物学操作方法1 9 2 2 重组酶表达质粒( 2 1 ，2 2 见第二章第一节) 1 9 2 3 利用I S c e I 消除卡那霉素抗性片段的方法1 9 3 结果1 93 1H A S n e o - S H A 基因敲入的实验2 0 3 2 基于归巢内切酶I S c e I 双链断裂消除抗性2 4 3 3 电转化效率的比较2 5 4 小结2 7 第三章T E V 蛋白酶细胞内剪切融合蛋白体系的构建2 8 第一节T E V 蛋白酶细胞内剪切融合蛋白体系的碳素2 8 1
6、| 实验材料2 8 1 1 菌种和质粒2 8 1 2 培养基的配置2 9 1 3 主要工具酶及化学试剂。2 9 1 4 主要仪器设备及来源2 9 1 5 引物合成与测序2 9 2 实验方法，3 1 2 1 常规分子生物学操作方法3 1 2 2 重组酶表达质粒3 1 2 3 同源重组介导将H A m T E V b l a H A 融合到B L 2 1 ( D E 3 ) 基因组中3 1 3 实验结果3 2 3 1 质粒的构建3 2 3 2 重组片段的扩增3 2 3 3 重组工程介导重组片段整合到B L 2 1 ( D E 3 ) 基因组中基因型的验 证3 33 4T E V 蛋白酶的表达3 3
7、3 5T E V 蛋白酶和融合蛋白的共表达3 4 第二节B L 2 1 ( D E 3 ) t e t R p t e t A m T E V 的构建3 5 l 实验材料3 5 1 1 所用菌株和质粒。3 5 1 2 培养基的配置3 6 1 3 主要工具酶及化学试剂3 6 1 4 主要仪器设备及来源3 6 1 5 引物合成与测序3 6 2 实验方法3 7 3 实验结果3 7 3 1 相关质粒( p R 6 K M C S 和p L S l 9 2 1 ) 的构建3 7 3 2 重组片段( H A c a t t e t R p t e t A H A ) 的扩增3 8目录鹪驰们“汪一一一一验一
8、一一一的一一一一型一因一一一一基一一一一子一一一一组一一重一一一一躺峪；|小一一 4献一一文考录谢参附致名词简写名词简写英文缩写英文全称中文全称A pA m p i c i l l i n氨苄青霉素A P SA m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵b pB a s e p a i r碱基对B S AB o v i n eS e r u mA l b u m i n牛血清白蛋白 C mC h l o r a r n p h e n i c o l氯霉素 D N AD e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d N
9、T Pd e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸 G mG e n t a m y c i n庆大霉素 H AH o m o l o g o u sa l T O同源臂m T G - s o p r o p y - I B - D - 1 - T h i o g a l a c t o p y r a n 。s ；d e主亲喜书国一硫代半I - S c e Il - S c e Ih o m i n ge n d o n u c l e a s eI - S c e I 归巢内切酶K a nK a n
10、a m y c i n卡那霉素 O DO p t i c a lD e n s i t y光密度O E P C Ro v e r l a pe x t e n s i o nP C R重叠延伸P C R P C RP o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n聚合酶链式反应R e d E TR e c o m b i n e e r i n g重组工程r p mr o u n d sp e rm i n u t e每分钟转速 S D SS o d i u mD o d e c y lS u l f a t e十二烷基磺酸钠S p e cS p e c t
11、 i n o m y c i n壮观霉素T cT e t r a c y c l i n e四环素T E M E DN , N ，N ，N T e t r 锄e t h y l e t h y l e n e d i a m i n eN ，N ，N 。，N - 四甲基二乙胺 T E VT o b a c c oe t c hv i r u s烟草蚀纹病毒t e tT e t r a c y c l i n er e s i s t a n c eg e n e四环素抗性基因X - G a l5 - B r o m o 一4 一C h l o r o - 3 - I n d o l y l p
12、 D G a l a c t o s i d e5 一溴4 一氯3 吲哚：旦：堡兰塾塑董I V摘要摘要随着分子生物学的发展，同源重组工程已经成为基因工程实验中常用的技术手段，广泛的应用在大肠杆菌基因组修饰，例如点突变，基因敲除等实验。相对比于传统同源的R e c A 重组系统，R e d 同源重组技术具有同源序列短( 4 0 - 6 0b p ) 、重组效率高的特点，这也是R e d 的到广泛应用的原因之一。B L 2 1 ( D E 3 ) 重组体系的建立，首先对蛋白表达宿主菌B L 2 1 ( D E 3 ) q b 进行基因敲除的可行性进行验证即对B L 2 1 ( D E 3 ) 上的r e c J 基因的敲除，实验证明：含5 0 b p ，5 0 0 b p 的重组片段均能够成功的敲入到B L 2I ( D E 3 ) 基因组上，从而取代r e c J o 确定B L 2 1 ( D E 3 ) 基因敲除可行后敲除B L 2 1 ( D E 3 ) 基因组上的细钡基因。核酸内切酶相关的基因胁搬一编码表达I 型限制酶E
