《大鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用（82页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四军医大学硕士学位论文大鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步 应用姓名：滕光菊申请学位级别：硕士专业：内科学（传染病学）指导教师：白雪帆2003.5.1独创牲声明0s 0 7 7 6 , 5秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本 声明所呈交的论文是挂个八在导师指导下进行的研究工1 t - 及取得的研究成果尽掩所知，除了交中特刺枷L 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果不包含本人或他八已申请学位或其他用选使用过的成果与莪一同I1 1 - 的同志对本研究所傲的住何贡献均已在论文中作了明确的i 明并表示了致谢申请学位论文与资料若有不宴之处本八承担一切相关
2、责任论文1 f 吉签g ：! 歪垒多口期：J m i - jH保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知i ：产权的现定，即研究主在校攻读学1 9 _ 期闻论文工作的知识产权单位属第四军医大学本 保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作戚果时署名单位仍然为第四军医大学学校百权保留送交论文韵复印件，允许论文被查闻相借同：学较可以公布论文的全部或部甜内容( 保密内容除9 J ，可以采用影印缩印或其他复制手段保存论文。论文I Y - 者蔓各：j l 茎生n 导师簦g第四军医大掌硕士学位论文英文缩略词对照表英文缩写英文全称中文词义a F G FA L BA I JA S TA H FA s c
3、2 PA T Pb F G FB L S SB r d uC KC H FC x2 6C x3 2C T LD M N AD M S OD - g a lE C ME G FF B Sa c i d i cf i h r o b l a s tg r o w t hf a c t o ra l b u m i na l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s ea c u t eh e p a t i cf a i l u r ea s c o r b i ca
4、 c i d2 - p h o s p h a t ea d e n o s i n et r i p h o s p h a t eb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rb i o a r t i f i c i a ll i v e rs u p p o r ts y s t e mh r o m o d e o x y u r i d i n ec y t o k e r a t i nc h r o n i ch e p a t i cf a i l u r ec o n n e x i n2 6c o n n e x i
5、n3 2c y t o t o x i cTl y m p h o c y t e sd i m e t h y ln i t r a m i n ed i m e t h y ls u l f o x i d eD - g a l a c t o s a m i n ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xe p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r侥t a Ib o v i n e m m酸性成纤维细胞生长因子白蛋白丙氨酸氨基转移酶天门冬氨酸氨基转移酶急性肝衰竭二磷酸抗坏血酸三磷酸腺苷碱性成纤维细胞生长因子生物人工肝支持系
6、统5 溴- 2 脱氧尿苷细胞角蛋白慢性肝功能衰竭连接蛋白2 6连接蛋白3 2细胞毒性T 淋巴细胞二甲基硝胺二甲基亚砜口氨基半乳糖细胞外基质表皮生长因子胎牛血清G 6 P a s eg l u c o s e - 6 p h o s p h a t a s e葡萄糖一6 一磷酸酶第四军医大掌硕士掌位论文 I _ _ _ _ - _ _ _ _ l _ _ _ _ _ _ I _ _ - _ _ _ - - _ 一-英文缩写英文全称中文词义H T xh e p a t o c y t et r a n s p l a n t a t i o n肝细胞移植H Eh e m a t o x y l i
7、 na n de o s i n苏木精伊红H S C sh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s肝星形细胞H G Fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r肝细胞生长因子L S C sl i v e rs t e mc e l l s肝千细胞L P Sl i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖L E C sl i v e re p i t h e l i a lc e l l s肝上皮细胞L D Hl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e乳酸脱氢酶L
8、 D Ll o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n s低密度脂蛋白L D L Rl o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n sr e c e p t o r低密度脂蛋白受体M A P C sm u l t i p o t e n r ta d u l tp r o g e n i t o rc e l l s多潜能成年祖细胞M H V - 3m u r i n eh e p a t i t i sv i r u ss t r a i n3鼠肝炎病毒3N P C sn o n p a r e n c h y m
9、a lc e l l s非实质细胞N A Dn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸O L To r t h o t o p i cl i v e rt r a n s p l a n t a t i o n原位肝移植P A Sp e r i o d i ca c i d ，S c h i f f r e a c t i o n高碘酸希夫反应P P Hp r i m a r yp o r c i n eh e p a t o c y t e原代猪肝细胞P E R Vp o r c i n ee
10、n d o g e n o u sr e t r o v i r u s猪内源性逆转录病毒P U Fp o l y a n e t h a n ef o a m聚氨醣泡沫S E Cs i n u s o i d a le n d o t h e l i a lc e l l s肝窦内皮细胞S V 4 0s i m i a nv i r u4 0猿猴病毒4 0T B i lt o t a lb i l i r u b i n总腮红素T G F at r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - q转化生长因子- C l2 -第四军医大学硕士学位论文大
11、鼠原代肝细胞的培养、功能鉴定及其在肝细胞移植中的初步应用硕士研究生：滕光菊导师：白雪帆教授辅导老师：黄长形副教授摘要r 肝功能衰竭是各类重型肝炎和晚期肝硬化患者的主要死因，虽然，肝移植术已明显改善了肝功能衰竭患者的预后，但是由于健康供肝短缺及昂贵的价格，该项手术在未来数年内还难以在国内外普遍开展。生物人工肝支持治疗技术和肝细胞移植的兴起，为许多肝功能衰竭患者带来了新的希望，许多学者成功地应用肝细胞移植或肝细胞为基础的生物人工肝治疗了严重的肝衰竭及晚期代谢性肝病患者，研究表明原代肝细胞是肝细胞移植和生物人工肝最理想的生物材料。离体培养的肝细胞在短期内形态和功能会发生明显变化，为了了解这些变化，探
12、讨其短期内培养的最佳功能状态，为临床进行肝细胞移植和生物人工肝治疗提供实验依据，我们采用S e g l e n 报道的改良二步胶原酶灌流法并略加修改进行大鼠肝细胞的分离及纯化，获取的肝细胞在含有多种辅助因子的W i l l i a m s E 培养基中进行单层培养。通过台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率；M T T 比色法检测连续培养8 d 肝细胞的活力；光镜、H E 染色以及S A B C 免疫组化方法动态观察细胞形态学改变，透射电镜观察其超微结构；用细胞化学方法测定G 6 - P a s e 活性：并收集不同时期培第。t m 军医大掌硕士掌位论文养上清检测肝细胞自蛋白分泌、尿素合成功能及L
13、 D H 漏出量。结果显示平均每只大鼠肝可获取1 2 l 0 4 5 1 0 8 个肝细胞，平均活力为9 3 6 4 - 2 8。M T T 实验结果显示肝细胞培养第3 dA 值较高，细胞活力处于最佳状态。光镜下可见肝细胞里多角形生长，有双核，连接成片状或岛状，能存活3 周左右。H E 染色显示细胞清晰，胞浆红染、胞核呈蓝色，可见双核。透射电镜下可见大量内质网、车轮状线粒体、糖原颖粒、细胞紧密连接及胆小管等肝细胞特征性结构。免疫组化结果显示细胞角蛋白1 8 阳性表达。镜下观察表达G 6 P a s e 的肝细胞阳性表达，细胞胞浆呈棕黑色颗粒。肝细胞功能检测显示L D H 漏出量、白蛋白分泌及尿
14、素合成功能在1 周内出现波动性变化，第3 dL D H 漏出量最低，白蛋白分泌及尿素合成功能在第3 、4 d 时较好。肝细胞移植已开始用于临床，并取得了一定的疗效，但用于移植肝细胞的最佳状态和适宜时机，目前还不太清楚。为此我们用剂量为2 0 9 k g胁氨基半乳糖制备大鼠急性肝衰模型，2 4 h 后随机分为3 组进行肝细胞移植治疗，I 组：经脾内移植体外培养3 d 的肝细胞；I I 组：经脾内移植预孵育8 h 的肝细胞悬液1 1 0 7 ；I I I 组：经脾内注射生理盐水l m l 。连续2 周观察移植后大鼠存活率，自动生化分析仪检测肝脏生化指标( A L l “ 、A S T 、T B i
15、 l ) ，H E 、P A S 染色观察肝脏组织学及移植后脾内肝细胞的生物学特性，以比较体外短期培养的肝细胞和新分离的肝细胞悬液经脾内移植治疗急性肝衰竭大鼠的疗效，为探索移植肝细胞的最佳状态和适宜时间提供实验依据。资料显示，I 组、l I 组大鼠存活率( 7 8 ，7 1 ) 与组大鼠存活率( 2 3 ) 相比具有显著性差异( J P 1 0 6 0 # m L ( 为1 0 7 0 1 0 9 0 9 m L ) ，其余的5 1 0 大鼠活肝细胞浮力密度为1 0 6 0 I 0 7 8 9 m L ，但N P C s 为1 0 4 1 0 6 9 m L 呻。差速离心法是肝实质细胞分离的经
16、典方法，也是实质细胞与其他N P C s 分离的基本方法。该方法的依据在于实质肝细胞与其他N P C s 在大小比重上有显著差异，实质细胞体积和比重较N P C s 大得多。通常情况下，大鼠经门静脉灌注胶原酶和低速离心，可得到较好的肝细胞悬液，通常受到其它肝细胞的污染率低于O 1 0 5 “剐。此外，通过血细胞分析仪对肝细胞进行自动冲洗和纯化，不仅快速方便，且能确保无菌。还可采用其它纯化方法，如自由电泳分离法、选择性贴壁或黏附法、荧光激活细胞分选等。第四军医大掌硕士学位论文4 3 体外培养肝细胞功能新分离的肝细胞通常丧失了结构极性，多呈球形，缺少细胞膜特异性结构，如毛细胆管等1 。但分离的肝细胞经培养后可重建功能极性。分离的大鼠肝细胞在最初培养1 2 h 就具有合成白蛋白和纤维蛋白原的能力，A T P 水平及R N A D N A 比例与体内相似，进一步用免疫组化方法证实培养的成年大鼠肝细胞具有合成I 、和型胶原酶的能力“。在肝脏
