PNH克隆化检测方案指南

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1、PNH克隆化检测方案指南克隆化检测方案指南克隆化检测方案指南克隆化检测方案指南岳保红岳保红岳保红岳保红教授教授教授教授、主任技师主任技师主任技师主任技师、硕士生导师硕士生导师硕士生导师硕士生导师、医学博士医学博士医学博士医学博士郑州大学一附院检验科血液细胞室郑州大学一附院检验科血液细胞室郑州大学一附院检验科血液细胞室郑州大学一附院检验科血液细胞室郑州大学医学检验系临床血液学检验教研室郑州大学医学检验系临床血液学检验教研室郑州大学医学检验系临床血液学检验教研室郑州大学医学检验系临床血液学检验教研室PNH概述概述概述概述1PNH?Paroxysmal nocturnal hemoglobinuri

2、a?阵发性睡眠性血红蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿阵发性睡眠性血红蛋白尿?PNH是一种由于造血干细胞是一种由于造血干细胞是一种由于造血干细胞是一种由于造血干细胞“磷酸酰肌醇糖苷磷酸酰肌醇糖苷磷酸酰肌醇糖苷磷酸酰肌醇糖苷A （PIG-A）”基因突变所致的疾病基因突变所致的疾病基因突变所致的疾病基因突变所致的疾病，表现为后天获表现为后天获表现为后天获表现为后天获 得性红细胞膜内在缺陷的慢性血管内溶血性贫血得性红细胞膜内在缺陷的慢性血管内溶血性贫血得性红细胞膜内在缺陷的慢性血管内溶血性贫血得性红细胞膜内在缺陷的慢性血管内溶血性贫血?临床上主要以慢性血管内溶血性和血红蛋白尿为临床上

3、主要以慢性血管内溶血性和血红蛋白尿为临床上主要以慢性血管内溶血性和血红蛋白尿为临床上主要以慢性血管内溶血性和血红蛋白尿为 特征特征特征特征特征特征特征特征1. 红细胞膜对补体敏感红细胞膜对补体敏感红细胞膜对补体敏感红细胞膜对补体敏感2. 慢性血管内溶血慢性血管内溶血慢性血管内溶血慢性血管内溶血3. 血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿（间歇间歇间歇间歇、睡眠睡眠睡眠睡眠）4. 全血细胞减少全血细胞减少全血细胞减少全血细胞减少5. 反复血栓形成反复血栓形成反复血栓形成反复血栓形成机制机制机制机制：PIG-A突变突变突变突变- GPI锚连膜蛋白缺失锚连膜蛋白缺失锚连膜蛋白缺失锚连膜蛋白缺失1.

4、 GPI锚连膜蛋白锚连膜蛋白锚连膜蛋白锚连膜蛋白：连接蛋白连接蛋白连接蛋白连接蛋白 特定蛋白特定蛋白特定蛋白特定蛋白：抑制补体激活抑制补体激活抑制补体激活抑制补体激活、膜反应性溶解膜反应性溶解膜反应性溶解膜反应性溶解 2. CD55 衰变加速因子衰变加速因子衰变加速因子衰变加速因子：补体激活的补体激活的补体激活的补体激活的C3、C5转化酶水平转化酶水平转化酶水平转化酶水平 抑制抑制抑制抑制 CD59 反应性溶血膜抑制物反应性溶血膜抑制物反应性溶血膜抑制物反应性溶血膜抑制物：阻止补体阻止补体阻止补体阻止补体C9转变成攻膜转变成攻膜转变成攻膜转变成攻膜 复合物复合物复合物复合物 3. 同时发生在红

5、细胞同时发生在红细胞同时发生在红细胞同时发生在红细胞、粒细胞粒细胞粒细胞粒细胞、单核细胞单核细胞单核细胞单核细胞、淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞临床表现临床表现临床表现临床表现1. 血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿，酱油或葡萄酒尿酱油或葡萄酒尿酱油或葡萄酒尿酱油或葡萄酒尿，与睡眠有关与睡眠有关与睡眠有关与睡眠有关 2. 贫血贫血贫血贫血、感染感染感染感染、出血出血出血出血，再障再障再障再障- PNH综合症综合症综合症综合症 3. 血栓形成血栓形成血栓形成血栓形成，溶血促凝物质释放溶血促凝物质释放溶血促凝物质释放溶血促凝物质释放+补体作用于血小板补体作用于血小板补体作用于血小板补体作用

6、于血小板PNH正常正常正常正常C=OAspC=O22OO=P=OOOCHCHCHC=OOCH2CH2NHCH2 CH2NHO2OO-P=OO-P-OOON( 1-2)( 1-6)( 1-4)PROTEINC=OAspC=O22OO=P=OOOCHCHCHC=OOCH2CH2NHCH2 CH2NHO2OO-P=OO-P-OOON( 1-2)( 1-6)( 1-4)PROTEINGPI-锚和膜蛋白锚和膜蛋白锚和膜蛋白锚和膜蛋白?PNH 红细胞缺失红细胞缺失红细胞缺失红细胞缺失?CD55?CD59CD59CD59的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形

7、成的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形成的缺失导致补体攻膜复合物的形成C5b-8C5b-8CD55CD59C9C9C9CD59Walport MJ, et al. N Engl J Med2001;344:1058-1066+实验室检查实验室检查实验室检查实验室检查1. 血象血象血象血象：血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白60g/L，粒细胞粒细胞粒细胞粒细胞、血小板或全血细血小板或全血细血小板或全血细血小板或全血细 胞减少胞减少胞减少胞减少 2. 骨髓象骨髓象骨髓象骨髓象：三系增生活跃三系增生活跃三系增生活跃三系增

8、生活跃，幼红细胞为主幼红细胞为主幼红细胞为主幼红细胞为主，或增生低或增生低或增生低或增生低 下下下下/再障再障再障再障 3. 溶血检查溶血检查溶血检查溶血检查： 血清游离血红蛋白血清游离血红蛋白血清游离血红蛋白血清游离血红蛋白：升高升高升高升高 结合珠蛋白结合珠蛋白结合珠蛋白结合珠蛋白：下降下降下降下降 血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿：阳性阳性阳性阳性 尿含铁血黄素尿含铁血黄素尿含铁血黄素尿含铁血黄素（Rous试验试验试验试验）：）：）：）：阳性阳性阳性阳性 4. 血清学实验血清学实验血清学实验血清学实验： Ham试验试验试验试验PNH的诊断的诊断的诊断的诊断2PNH检测临床适应证检

9、测临床适应证检测临床适应证检测临床适应证1.血管内溶血血管内溶血血管内溶血血管内溶血 证据证据证据证据：血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿血红蛋白尿、血浆血红蛋白增高血浆血红蛋白增高血浆血红蛋白增高血浆血红蛋白增高 2.不能解释的溶血现象不能解释的溶血现象不能解释的溶血现象不能解释的溶血现象，同时伴随有同时伴随有同时伴随有同时伴随有： IDA、腹痛腹痛腹痛腹痛、食管痉挛食管痉挛食管痉挛食管痉挛、血栓血栓血栓血栓、粒细胞减少粒细胞减少粒细胞减少粒细胞减少、血小板减少血小板减少血小板减少血小板减少 3.一些一些一些一些Coombs阴性的溶血阴性的溶血阴性的溶血阴性的溶血 4.非常规表现的血栓形成非常规

10、表现的血栓形成非常规表现的血栓形成非常规表现的血栓形成 不常见的位置不常见的位置不常见的位置不常见的位置、伴有溶血性贫血伴有溶血性贫血伴有溶血性贫血伴有溶血性贫血、伴不能解释的血细胞减少伴不能解释的血细胞减少伴不能解释的血细胞减少伴不能解释的血细胞减少 5.有骨髓衰竭证据有骨髓衰竭证据有骨髓衰竭证据有骨髓衰竭证据 怀疑或证实怀疑或证实怀疑或证实怀疑或证实AA或增生不良性贫血或增生不良性贫血或增生不良性贫血或增生不良性贫血 RCUD 其他不明原因的血细胞减少其他不明原因的血细胞减少其他不明原因的血细胞减少其他不明原因的血细胞减少（多种检查完成后多种检查完成后多种检查完成后多种检查完成后）CD55

11、、 CD59酸溶血试验酸溶血试验酸溶血试验酸溶血试验（ Ham test） 蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验蔗糖溶血试验FLAER ( ( ( (嗜水气单胞嗜水气单胞嗜水气单胞嗜水气单胞 菌溶血素菌溶血素菌溶血素菌溶血素) ) ) )RBCsRBCs & LeukocyteLeukocyte检测内容检测内容检测内容检测内容Ham test: 特异但不敏感特异但不敏感特异但不敏感特异但不敏感 Flow cytometry: 评价血细胞膜上存在或缺失评价血细胞膜上存在或缺失评价血细胞膜上存在或缺失评价血细胞膜上存在或缺失GPI连接的膜蛋白连接的膜蛋白连接的膜蛋白连接的膜蛋白 CD55 and

12、CD59 FLAER?Clinical Cytometry，2010，78:211230?Guidelines for the Diagnosis and Monitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria and Related Disorders by Flow Cytometry. FLAER（fluorescent aerolysin）?荧光标记的荧光标记的荧光标记的荧光标记的“嗜水气单胞菌溶素嗜水气单胞菌溶素嗜水气单胞菌溶素嗜水气单胞菌溶素”，能特异性结合能特异性结合能特异性结合能特异性结合GPI-锚锚锚锚?一旦与一旦与一旦与一旦与GP

13、I结合结合结合结合，显示荧光显示荧光显示荧光显示荧光?PNH细胞缺乏或部分缺乏细胞缺乏或部分缺乏细胞缺乏或部分缺乏细胞缺乏或部分缺乏GPI，可测定荧光强度并计数可测定荧光强度并计数可测定荧光强度并计数可测定荧光强度并计数?FLAER 为为为为PNH测定提供有明显优势的试剂测定提供有明显优势的试剂测定提供有明显优势的试剂测定提供有明显优势的试剂FLARE和和和和GPI连接蛋白检测的比较连接蛋白检测的比较连接蛋白检测的比较连接蛋白检测的比较3流式细胞术测定流式细胞术测定流式细胞术测定流式细胞术测定PNH常规和高敏感性分析的设门策略常规和高敏感性分析的设门策略常规和高敏感性分析的设门策略常规和高敏感

14、性分析的设门策略标本准备标本准备标本准备标本准备溶血和细胞获取溶血和细胞获取溶血和细胞获取溶血和细胞获取RBC 分析分析分析分析常规检测常规检测常规检测常规检测1白细胞分析白细胞分析白细胞分析白细胞分析常规检测常规检测常规检测常规检测2高敏感性检测高敏感性检测高敏感性检测高敏感性检测31.RBC1.RBC分析分析分析分析分析分析分析分析常规检测常规检测常规检测常规检测常规检测常规检测常规检测常规检测抗体过量抗体过量抗体过量抗体过量抗体选择抗体选择抗体选择抗体选择图形与设门图形与设门图形与设门图形与设门RBC分型分型分型分型RBCRBC分析分析分析分析分析分析分析分析常规检测常规检测常规检测常规

15、检测常规检测常规检测常规检测常规检测?单一红细胞测定单一红细胞测定单一红细胞测定单一红细胞测定PNH不能充分评价不能充分评价不能充分评价不能充分评价PNH患者患者患者患者，因为溶血因为溶血因为溶血因为溶血和输血能明显掩盖和输血能明显掩盖和输血能明显掩盖和输血能明显掩盖、低估低估低估低估PNH克隆的大小克隆的大小克隆的大小克隆的大小PNHPNH红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型红细胞的分型II 型型型型： ： ： ：CD59部分缺失的部分缺失的部分缺失的部分缺失的红细红细红细红细 胞克隆胞克隆胞克隆胞克隆， ， ， ，和和和和III型型型型： ： ： ：CD59完全缺完全缺完全缺完全缺 失的失的失的失的红细红细红细红细胞克隆胞克隆胞克隆胞克隆III型型型型： ： ： ： CD59完全缺失的完全缺失的完全缺失的完全缺失的红细红细红细红细 胞克隆胞克隆胞克隆胞克隆I型型型型： ： ： ：带带带带正常量正常量正常量正常量CD59的正常的正常的正常的正常 RBC设门设门设门设门： ： ： ：GPA+RBC同一同一同一同一PNH标本粒细胞分析标本粒细胞分析标本粒细胞分析标本粒细胞分析(A) 和红细胞和红细胞和红细胞和红细胞(B)分析分析分析分析 粒细胞克隆占粒细胞克隆占粒细胞克隆占粒细胞克隆占55%，红细胞克隆占红细胞克隆占红细胞克隆占