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1、1“咳喘宁”贴膏皮肤用药毒性实验研究作者：王晶，关东升，陈淑彦，司小兵 摘 要：目的：探讨“咳喘宁”贴膏皮肤用药的安全性。方法：通过对健康家兔皮肤急性毒性试验、健康豚鼠皮肤刺激性试验及皮肤过敏性试验，观察“咳喘宁”贴膏对动物经皮肤用药的急毒、刺激和过敏性。结果：“咳喘宁”贴膏对家兔完整皮肤和破损皮肤未引起急性毒性反应；对豚鼠完整皮肤和破损皮肤有轻度刺激性，但给药后 48 h，这种刺激性消失；对豚鼠完整皮肤无致敏作用。结论：“咳喘宁”贴膏临床用药安全、无毒。 关键词：“咳喘宁”贴膏；急性毒性；皮肤刺激性；皮肤过敏性“咳喘宁”贴膏是甘肃中医学院刘世琼教授经过多年临床验证，并结合现代药理研究，反复筛
2、选研制而成的纯中药外用穴位贴剂。其应用简单、经济，多年来常在“三伏天”用于治疗支气管哮喘和慢性支气管炎，疗效十分肯定。为研究其用药的安全性，本实验进行了“咳喘宁”贴膏皮肤用药的动物毒性实验研究，并为本产品的开发提供理论依据。1 材料21.1 实验动物健康成年家兔 12 只，雌雄各半，体重 2.00.5 kg（兰州生物制品研究所动物实验室提供，合格证号：医动字第 14-004 号） ；健康成年豚鼠 36 只，雌雄各半，体重 30050 g中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验室提供，合格证号 SCXK（甘）2004-0005 。1.2 实验药品“咳喘宁”贴膏（由白芥子、甘遂、延胡索、苏子、生姜汁等
3、组成） ，空白纱胶贴剂（有三层纱布和一层无刺激性胶布组成） ，以上两种受试物规格为：皮肤急性毒性试验为 7 cm10 cm，皮肤刺激性试验为 4 cm5 cm，皮肤过敏试验为 3 cm3 cm，均由“咳喘宁”贴膏课题组提供；2，4二硝基氯代苯（上海试剂一厂，批号 001201） ，分析纯硫化纳（莱阳化工实验厂，批号20040909） 。2 方法和结果2.1 “咳喘宁”贴膏的皮肤急性毒性试验32.1.1 试验方法动物分组：将 12 只家兔，按随机数字表法分为 3 组，每组4 只，雌雄各半。A 组（大剂量药物贴剂组，即贴敷 A 组，为临床用药药量的 6 倍） ；B 组（小剂量药物贴剂组，即贴敷 B
4、 组，为临床用药药量的 3 倍） ；C 组（空白纱胶贴剂对照组） 。操作方法：按文献1方法，用 3 份硫化钠，1 份皂粉，7份淀粉，加水配成糊状软膏，将家兔右侧背部脱毛 70 cm2 而不受伤， 24 h 后，用 75%乙醇消毒。按文献2-3 方法，A 组于脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量 4 g） ， 8 h 后去掉，每天 1 次，共贴 6 次；B 组于脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量 4 g） ，6 h 后去掉，隔天 1 次，共贴 4 次；C 组脱毛处敷贴滴 4 mL 生理盐水的空白纱胶贴剂。然后轻轻按压 2 次，再用不干胶布固定，分笼饲养。末次除去受试物后，用温水除去残留受试物，于去
5、掉受试物1、24 、48、72 h 至 7 d，每日观察动物的体重、皮肤毛发、饮食、二便、呼吸、眼和黏膜的变化、精神状态、四肢活动及死亡情况。如果对完整皮肤无毒性反应，则在家兔左侧背部脱毛 70 cm2，24 h 后，用碘伏和 75%乙醇消毒皮肤，再用消毒处理的 400 号细砂纸在脱毛处造成擦伤，使皮肤出现密集出血点，以渗血为度，立即在擦伤部位敷贴受试物。具体方法及观察指标同上，并进行三组的对照比较。如遇死亡，应及时进行尸检和肉眼观察，当肉眼可见病变4时，应进行病理组织学检查。2.1.2 结果HT“咳喘宁”贴膏高低剂量应用后，完整皮肤及破损皮肤家兔皮毛光泽正常，对家兔的饮食、二便、呼吸、眼和黏
6、膜变化，精神状态，四肢活动均未造成任何影响，破损皮肤均在给药后第 2 d 出现点状血痂，第 7 d 内脱痂痊愈。在观察期 14 d 内未出现急性毒性反应，无一只家兔死亡。与对照组体重比较，结果见表 1。表“咳喘宁”贴膏对皮肤急性毒性试验家兔体重的影响表 1 显示:A、B 组与 C 组比较无显著性差异(P0.05)，说明本药对家兔体重无影响。2.2“咳喘宁” 贴膏的皮肤刺激性试验4-52.2.1 试验方法动物分组：将 12 只豚鼠按随机数字表法随机分为 A 组（完整皮肤组） 、B 组（破损皮肤组）2 组，每组 6 只，雌雄各半。操作方法：按文献1方法，于给药前 24 h 将豚鼠脊柱两侧对称脱毛
7、2 块而不损伤皮肤，每块去毛面积约 4 cm5 cm（约5相当于豚鼠体表面积的 10 %） ，具体操作方法同皮肤急性毒性试验脱毛法。给药采用左右侧自身对照。A 组用 75%乙醇消毒后，左侧脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量 4 g） ，右侧敷贴滴生理盐水 4 mL 的空白纱胶贴剂，8 h 后去掉，每天 1 次，连续给药 6 d。B 组用碘伏、75%乙醇消毒皮肤，再用消毒处理的 400 号细纱纸在脱毛处造成擦伤，使皮肤出现密集出血点，以渗血为度，立即在擦伤部位敷贴受试物，具体方法同 A 组（完整皮肤组） ，每天 1 次，连续给药 6 d。末次敷贴受试物后，用温水除去残留受试物，分别于去掉受试物后
8、 1、24、48、72 h 观察涂抹部位有无红斑和水肿情况，是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄。按文献6中“皮肤刺激性反应评分标准”每日进行刺激反应评分，记录各组每日的评分值，计算刺激指数平均值:刺激指数平均值=（红斑形成总分+ 水肿形成总分）/动物总数，按文献6中“皮肤刺激强度评价标准”评价皮肤刺激强度。2.2.2 试验结果 见表 2。经过观察发现，豚鼠完整皮肤组与破损皮损组敷贴“咳喘宁”贴膏后 1 h，豚鼠皮肤用药部位有不明显红斑，个别出现明显红斑，无水肿，刺激强度为轻度刺激性，但以上皮肤改变在6去除药物后 48 h 内逐渐消失，各组自身对照部位均无红斑、水肿出现，刺激强度小于 0
9、.56 ，为无刺激性反应。两组皮肤均无色素沉着、出血点、粗糙和菲薄情况，损伤皮肤组动物皮肤有点状血痂，至 48 h 开始脱落，给药区与其自身对照区无明显差异（ P0.05） ，故血痂是擦伤所致，非药物引起，且破损皮肤组动物皮肤光泽程度、弹性与完整皮肤组无显著差异。表 2“咳喘宁 ”贴膏对豚鼠皮肤的刺激试验 注：A 无刺激性; B 轻度刺激性2.3“咳喘宁” 贴膏的皮肤过敏试验 3，7皮肤过敏试验是通过动物重复接触受试物后，观察机体免疫系统在皮肤上的反应。是应用受试物后产生免疫学传递的一种皮肤反应。在动物首次接触供试品一段时间后，再次进行供试品的激发接触，可观察动物是否已出现过敏状态，然后再通过
10、观察激发接触后的反应来判定受试动物有无发生过敏反应。2.3.1 试验方法动物分组：将 24 只豚鼠按随机数字表法随机分为 3 组，即A 组：阴性对照组（生理盐水） ；B 组：药物贴剂组（“咳喘宁”贴膏） ；C 组：阳性对照组用分析纯丙酮临用前配制成 1%的致敏浓度和 0.1%的激发浓度，即阳性致敏物为 1% 2，4二硝基氯代苯（DNCB） ，阳性激发物为 0.1% DNCB 。每组 8 只，雌雄各半。7操作方法： (1）致敏接触：给药前 24 h，将健康豚鼠背部脊柱左侧按文献1方法脱毛，具体操作方法同皮肤急性毒性试验脱毛法，脱毛区为 3 cm3 cm。用温水洗净豚鼠背部脊柱左侧皮肤后，A 组左
11、侧脱毛区敷贴滴 0.2 mL 生理盐水的空白纱胶贴剂；B 组左侧脱毛区敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量 0.2 g） ；C 组左侧脱毛区敷贴滴 1% DNCB 0.2 mL 空白纱胶贴剂。三组受试物均贴敷 6 h，试验第 7 d和第 14 d 以同样方法各重复 1 次，共计 3 次。(2）激发接触：于激发接触敷贴前 24 h，再次在右侧对称部位脱毛 3 cm3 cm,具体方法同上。于致敏接触末次给药后 14 d（第 28 d）在各组动物背部右侧脱毛区， A 组敷贴滴 0.2 mL 生理盐水的空白纱胶贴剂;B 组敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量 0.2 g）;C组敷贴滴 0.1% DNCB 0.2 mL
12、 空白纱胶贴剂固定，三组均贴敷 6 h后，去除并用温水洗净受试物，即刻观察。然后于 24、48 、72 h再次观察皮肤过敏反应情况，按文献6中“皮肤过敏反应程度的评分标准”给予评分，计算各组各时间平均分值，以反映受试物的致敏强度，同时观察豚鼠是否有站立不稳、休克等全身过敏反应，按公式计算致敏反应发生率：致敏反应发生率=有过敏反应动物数（无论程度轻重）/动物总数100% ，按文献6中“皮肤致敏性评价标准”依据致敏反应发生率评价致敏性。82.3.2 试验结果结果见表 3。表 3“咳喘宁”贴膏对豚鼠皮肤过敏反应分值及评价 药物贴剂组与阴性对照组致敏激发接触后观察，即刻至 72 h 激发接触部位均未出
13、现红斑及水肿，致敏率为 0，阳性对照组自激发给药 6 h 后，即刻观察该组 8 只豚鼠皮肤：2 只出现明显红斑为 22 分，其中 1 只伴勉强水肿为 11 分；6 只出现严重红斑为36 分，其中 1 只伴皮肤隆起约 1mm 水肿为 31 分，其中 3 只伴勉强水肿为 13 分，总积分 29 分，24 h 开始消退总积分为 20分，48 h 总积分 15 分，72 h 后可见红斑及水肿，总积分为 10 分，致敏率 100 %。与 A、B 组比较，有明显差异，表明“咳喘宁”贴膏对豚鼠皮肤无致敏作用。3 结论支气管哮喘及慢性支气管炎是临床上常见又难治的呼吸道疾病，无论中医西医目前对其都缺乏理想的治疗
14、方法。 “咳喘宁”贴膏是经导师多年临床验证，并结合现代药理研究，反复筛选研制而成的用于治疗支气管哮喘及慢性支气管炎行之有效的外用穴位贴剂。本贴剂敷贴于穴位表面，一是通过透皮吸收而发挥药物本身的治疗作用；二是通过对相关经络腧穴的刺激而发挥经络系统的调整作用；9三是该药贴多年来常在“三伏天”使用，能起到“时间疗法”作用，三重治疗而达到健脾益肾、降气平喘、化痰止咳的综合治疗作用，更加有效地促使病愈。 “咳喘宁”贴膏免疫学实验8也表明，该贴剂能提高机体的免疫功能，有较好的化痰平喘作用。本实验结果表明：“咳喘宁”贴膏不论外用于家兔完整皮肤，还是破损皮肤均无急性毒性；外用于豚鼠完整皮肤，特别是破损皮肤有轻
15、度刺激性，但给药后 48 h 内可自行消失，其试验使用剂量是临床用药药量的 6 倍，且由于 “咳喘宁”贴膏在临床应用时不是反复在同一穴位贴敷，故不影响药物治疗的连续性；外用于豚鼠皮肤无过敏反应。从毒理学方面说明“咳喘宁”贴膏穴位贴敷治疗支气管哮喘和慢性支气管炎是安全的外用制剂，值得临床推广应用及开发新产品。由于本处方不含毒性药物，故按文献6要求无需进行长期毒性试验。参考文献：1 郝光荣. 实验动物学 M.第 2 版.上海：第二军医大学出版社，2002：184-185.102 谢秀琼. 中药新制剂开发与应用M. 北京：人民卫出生版社，2002：565-570.3 钱芳，杨戒骄，杜琪, 等.伤疡愈
16、软膏皮肤毒性实验研究J.中国药房, 2004, 15（7 ）：405-406.4陈奇. 中药药理实验方法学 M.北京:人民卫生出版社，1996:164-167.5 韦京辰，徐庆，唐祖年. 乳癖贴皮肤毒性实验研究J. 华夏医学, 2004, 17（1）：19-20.6 中华人民共和国卫生部药政局.中药新药研究指南（药学、药理学、毒理学）M.北京：人民卫生出版社,1994:209-212.7 王玉芬，韩双红. 止痛涂膜药理作用研究J. 河北中医,2002,24（ 5）：394-397.8 刘世琼，张全爱. 咳喘灵贴膏贴敷穴位治疗豚鼠哮喘的实验研究J.中医药学刊 ,2004,22（4 ）：620-621.
