《慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中微小RNA的表达分析及其功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中微小RNA的表达分析及其功能研究（128页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号U D C博士学位论文密级慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中 微小R N A 的表达分析及其功能研究S t u d yo nm i c r o R N Ae x p r e s s i o na n df u n c t i o ni n p e r i o h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l sf r o mo a t i e n t s l 0 0 t lm o n o n u c l e a rc e l l sI r oa t i e n t sw i t hc h r o n i ch e p a t i t i
2、sBv i r u si n f e c t i o n作者姓名：学科专业：学院( 系、所) ：指导教师：、副指导教师：论文答辩日期! 一陈莉内科学( 感染病学)湘雅医院谭德明教授李聪智副教授答辩委员会主席中南大学 二零一二年九月一令一一，牛7 乙月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者盛名：! 生自日期：旦年兰月日学位论文版权
3、使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：j 生兰L 导师签名绘期：竺年二月兰日摘要研究背景：乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sBv i r u s ，H B V ) 感染所致的慢加急性肝衰竭( H B V - r e l a t e da c u t e o n c h r o
4、 n i cl i v e rf a i l u r e ，A C L F )是临床常见的危重症，病死率较高，对人类危害严重。关于A C L F 的发病机制，目前认为主要包括病毒复制和宿主免疫反应及其相互作用两个方面，但是H B V 无直接致细胞病变效应，其本身并不直接对感染细胞产生破坏效应，由此人们认为A C L F 发病机制的主要环节为病毒在一定条件下所诱发的宿主免疫应答异常。微小R N A ( m i c r o R N A ，m i R N A ) 是近年来新发现的一类非编码小分子R N A 。m i R N A 表达丰富，作用广泛，胚胎发育、细胞增殖分化均受m i R N A 的调控
5、，同时m i R N A 也参与机体免疫反应的调节。m i R N A 可以通过T o l l 样受体( T o l l 1 i k er e c e p t o r s ，T L R s ) 与细胞因子信号途径对机体固有免疫进行调控，也可通过干扰抗原呈递及T 细胞受体( Tc e l lr e c e p t o r s ，T C R s )途径对机体适应性免疫进行调控。作为机体免疫应答的始动者，m i R N A 在H B V 感染发病机制中的作用也日益得到重视。多项研究已经证实，多个m i R N A 参与控制H B V 复制、H B V 相关肝脏疾病的进展，尤其是肝硬化和肝细胞癌的进展
6、；也有研究发现对于接受干扰素( i n t e r f e r o n ，I F N ) 治疗的慢性H B V 或丙型肝炎病毒( h e p a t i t i sCv i r u s ，H C V ) 感染者，可利用患者外周血单个核细胞( P e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ，P B M C ) 中m i R N A 表达水平的变化来协助判断疾病的临床转归。然而关于m i R N A 与A C L F 的关系，目前知之甚少。研究目的：( 1 ) 了解肝脏炎症程度不同的慢性H B V 感染者P B M C中m i
7、 R N A 的表达谱。( 2 ) 确认慢性H B V 感染者P B M C 中是否存在与肝脏炎症程度相关的特异性m i R N A 。( 3 ) 对特异性m i R N A 可能的靶基因进行预测，了解慢性H B V 感染者P B M C 中特异性m i R N A 靶基因的表达水平。( 4 ) 对m i R 1 9 7 、m i R - 3 2 8 的靶基因进行确认，初步探讨慢性H B V 感染者体内m i R - 1 9 7 、m i R - 3 2 8 的作用途径。研究方法：( 1 ) 应用m i R N A 基因芯片技术对H B V 相关的4 例无症状携带者( a s y m p t
8、o m a t i cc a r r i e r ，A S C ) 及4 例A C L F 患者P B M C中m i R N A 的表达谱进行检测，对差异性表达的m i R N A 进行筛选。( 2 )采用T a r g e t S c a n5 2 ，D I A N A - m i c r o T3 0 及P i c t a r 生物软件对m i R - 1 9 7 、m i R - 3 2 8 的靶基因进行预测。( 3 ) 采用实时荧光定量聚合酶链式反应( r e a l - t i m ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r e
9、a l t i m eP C R ) 对H B V 相关的7 0 例A S C ，1 0 7 例慢性乙型肝炎( c h r o n i ch e p a t i t i sB ，C H B ) 患者，7 6 例A C L F 患者，及5 1 例健康对照者P B M C 中m i R - 1 5 0 、m i R - 1 9 7 、m i R 2 2 3 、m i R - 3 2 8 、m i R 3 0 a 、m i R 5 7 4 3 p 的表达水平进行验证分析；同时对P B M C 中m i R - 1 9 7 的靶基因白细胞介素1 8 ( i n t e d e u k i n1 8 ，
10、I L l 8 ) 、肿瘤坏死因子配体超家族1 0 ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rl i g a n ds u p e r f a m i l ym e m b e r1 0 ，T N F S F l 0 ) ，m i R 一3 2 8 的靶基因肿瘤坏死因子受体超家族9 ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o rs u p e r f a m i l ym e m b e r9 ，T N F R S F 9 ) 的m R N A 表达水平进行检测。( 4 ) 采用基因瞬时转染的方法，分别将
11、m i R - 1 9 7m i m i c 和i n h i b i t o r ；m i R - 3 2 8m i m i c 和i n h i b i t o r转染至单核细胞系T H P 1 细胞中，采用C C K 8 法检测各转染组及对I I照组细胞增殖率；酶联免疫吸附试验( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，E L I S A ) 检测各转染组及对照组细胞培养上清中I L l 8 表达水平；应用r e a l t i m eP C R 检测各转染组及对照组m i R 3 2 8 ，m i R 19
12、7 与T N F R S F 9 、T N F S F l 0 、I L l 8 的m R N A 表达水平：w e s t e r nb l o t 检测各转染组及对照组T N F R S F 9 、T N F S F l 0 的蛋白表达水平。研究结果：( 1 ) m i R N A 基因芯片检测显示慢性H B V 感染所致的A S C 与A C L F 患者P B M C 中共有1 7 个m i R N A s 出现差异性表达，与A S C 患者相比较，肝脏炎症活动明显的A C L F 患者P B M C 中h s a m i R - 1 2 4 6 、h s a m i R - 3 0
13、a 、h s a m i R 1 3 0 5 、h s a m i R 1 9 3 a 3 p 和h s a m i R - 1 9 6 b 共5 个m i R N A s 表达上调，同时h s a m i R - 2 2 3 、h s a m i R 5 7 4 3 p 、h s a m i R - 1 5 0 等1 2 个m i R N A s 表达下调。( 2 ) 对肝脏炎症程度不同的慢性H B V 感染者P B M C 中m i R N A 的表达水平扩大样本进行验证分析发现，m i R - 1 9 7 、m i R - 5 7 4 3 p 及m i R - 3 0 a 的P C R验
14、证分析结果与m i R N A 基因芯片分析结果一致，而m i R - 1 5 0 、m i R 2 2 3与m i R 3 2 8 的P C R 验证分析结果与m i R N A 基因芯片分析结果存在一定的差异。验证分析显示随着慢性H B V 感染者肝脏炎症程度的逐渐加重，m i R 1 9 7 的表达水平逐渐下调，而m i R - 3 2 8 的表达水平逐渐上调。同时，正常对照组P B M C 中m i R - 5 7 4 3 p 、m i R 3 0 a 的表达水平较慢性H B V 感染者明显升高；而与正常对照组相比较，A C L F 患者P B M C 中m i R - 1 5 0 表
15、达上调；但是各组间m i R 2 2 3 的表达水平无明显差异。( 3 ) T a r g e t S c a n5 2 等靶基因预测软件分析发现，m i R 1 9 7 可与T N F R S F 9 、T N F S F l 0 、I L l 8 的37 非编码区( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，U T R )I I I互补配对，m i R - 3 2 8 可与T N F R S F 9 的3 U T R 互补配对。肝脏炎症程度不同的慢性H B V 感染者P B M C 中，T N F R S F 9 的表达水平随肝脏炎症程度的加重而降低，与m i
16、 R 3 2 8 的表达水平趋势相反；T N F S F l 0 、I L l 8 的表达水平随肝脏炎症程度的加重而增加，与m i R 1 9 7 的表达水平趋势相反。( 4 ) 与空白转染组及m i m i cc o n t r o l ( m i R C ) 转染组，i n h i b i t o rc o n t r o l ( a n t i m i R C ) 转染组相比较，m i R 1 9 7m i m i c 转染组中I L l 8 、T N F R S F 9 、T N F S F l 0 的m R N A 及蛋白表达水平均降低，有显著性差异；m i R 1 9 7i n h i b i t o r 转染组中I L l 8 的m R N A 及蛋白表达水平均增加，有显著性差异；虽然m i R 1 9 7i n h i b i t o r 转染组中T N F R S F 9 的m R N A 表达水平明显增加，但是其蛋白表达水平并没有显著增加；同时，m i R 1
