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1、华中科技大学硕士学位论文全反式维甲酸对大鼠肺气肿模型干预作用的实验研究姓名：张培芳申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：辛建保2003.4.1华中科技大学同济医学院倾十研究生毕业论文全反式维甲酸对大鼠肺气肿模型干预作用的实验研究研究生张培芳 导师辛建保教授 华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科中文摘要 棚巾气肿是以肺终末细支气管远端发生异常持久的气腔扩大，伴肺泡壁 结构礅坏而无明显纤维化的慢性疾病。但其发病机制尚不清楚。构成肺泡壁的细胞外基质( e x t r a c e l u a rm a t t i X ，E C M ) 处于不断的合成和降解的动态平衡，其中基质金属蛋白酶及其抑制
2、因子发挥重要作用。目前国内对于基质金属蛋白酶一9 ( M M P 一9 ) 和金属蛋白酶组织抑伟蛴0 一l ( T I M P 一1 ) 的动态平、 衡在肺气肿肺组织气道重塑中的作用研究较少0 ，本实验中，我们采用免疫 ， 细胞和组织化学、原位杂交等技术，对肺气肿大鼠模型肺组织和体外培养的肺泡巨噬细胞的M M P 一9 、T I M P 一1 表达进行研究；并通过观察戒烟、全反式维甲酸对肺气肿肺组织M M P 一9 、T I M P 】表达的影响探索其可能的作用机制，为慢性阻塞性肺疾病的治疗提供新思路。本实验分为三部分：第一部分M M P 9 和T I M P 1 在吸烟大鼠模型细胞外基质重塑
3、中的作用O 0 5 ) ；与健康对照组相比，吸烟4 和6 月组P a 0 2 明显下降( p 0 0 5 ) 。肺组织中M M P 一9 、T I M P l m R N A 和蛋白的阳性表达部位主要在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞，成纤维细胞等，呈棕黄色颗粒样改变。与吸烟4 月组相比，戒烟组I V 型胶原平均吸光度值明显升高( p O 0 5 ) ；药物对照组则与模型组比较差异不明显r P 0 0 5 ) 。三、动脉血气分析结果：( 见表1 )与健康对照组相比，模型组P a 0 2 明显下降( P O 0 1 ) ，氧饱和度明显下降( P 0 0 1 ) ，动脉血P a C 0 2 分压值显著
4、增高( P 0 0 1 ) ，提示大鼠已出现肺换气和通气功能障碍；维甲酸干预组P a 0 2 比模型组有明显改善( P O 0 1 ) ，P a C 0 2 明显减低( P 0 0 1 ) ，氧饱和度改善( P O 0 5 ) ；药物对照组较模型组P a 0 2 有改善( P O 0 5 ) ，余无明显差异性改变。四、肺泡巨噬细胞M M P 一9 、T I M P 1m R N A 和蛋白的表达：( 见表2 ，图1 - 2 )模型组大鼠肺泡巨噬细胞M M P 一9 、T 1 M P 一1 的m R N A 和蛋白表达量均比健康对照组增加( P O 0 1 ) ；药物对照组比模型组M M P 9
5、 m R N A 及蛋白华中科技大学同济医学院坝十硎究生毕业论文明显下降，T I M P 一1 升高( P O0 1 ) ；维甲酸干预组M M P 一9 m R N A 及蛋白比模型组显著下降( P O 0 0 1 ) ，T I M P 一1 明显上升( P 0 0 1 ) 。血、肺组织M M P 一9 、T I M P lm R N A 和蛋白、I V 型胶原的表达：( 见表3 - 4 ，图3 5 )模型组大鼠肺组织M M P 一9 、T I M P 一1 的m R N A 和蛋白表达均比健康对照组增i j n ( P O 0 1 ) ；与模型组相比，维甲酸干预组M M P 9 m R N
6、A 及蛋白明显下降( P O 0 1 ) ，T I M P 一1 明显上升( P O 0 1 ) ；药物对照组无明显改变。肺组织中M M P 9 、T I M P 1 的阳性表达部位主要是肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞，成纤维细胞等，呈棕黄色颗粒样改变。肺组织免疫组化结果示维甲酸干预组I v 型胶原平均吸光度值较模型组明显升高( P o 0 1 ) ，可能与组织修复有关。讨论慢性阻塞性肺疾病( C O P D ) 是具有气道阻塞特征的慢性疾病，吸烟是其重要致病因素。本试验通过被动吸烟方法制备大鼠阻塞性肺气肿模型，病理形态等检查符合典型肺气肿表现，血气分析结果也提示存在肺通气和换气功能障碍，表明模
7、型复制成功。基质金属蛋白酶类( M M P s ) 是一组由钙离子激活的含锌离子的内肽酶家族，具有高度同源性，M M P s 几乎能降解E C M 的所有成份，在炎症、创口愈合、肿瘤浸润等疾病过程中有重要作用。其主要由巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等合成与分泌。在支气管和肺泡，肺泡巨噬细胞是M M P s的主要来源，尤其在吸烟者【2 ，M M P s 分为五个亚类，包括胶原酶、明胶酶、基质水解素( m a t r i l y s i n ) 、膜型M M P s 、间充质溶解素( s t r o m o l y s i n s ) 。其中M M P 9 ，即明胶酶B ，主要作用底物包括、V 、
8、X 、X I 型胶原，明胶、弹性纤维等。在C O P D ，诱导痰和肺泡灌沈液中M M P 一9 含量增高 3 - 4 】。华巾科技大学同济医学院顺十删究生毕业沦文而T I M P s 是M M P s 的内源性天然抑制因子，广泛分布于组织和体液中，有四种亚类，即T I M P _ 】、2 、一3 、一4 ，主要与M M P s 形成1 ：1 复合体而抑制其活性。T 1 M P 。1 是所有亚类中活性最强的，其特异性抑制M M P 一9 活性，而T I M P 2 则特异性抑制M M P 一2 活性。其中，M M P 一9 T 1 M P I 的比例，目f j 被认为是反映气道组织破坏与修复动
9、态平衡的标志。本研究显示，C O P D 模型组肺泡巨噬细胞M M P - 9 、T I M P 一1 m R N A 和蛋白水平均比健康对照组明显上升，M M P 一9 增加更为显著，肺组织M M P 一9和T I M P 一1 的表达亦明显上升，而M M P 一9 T I M P 1 比值上升，提示随烟雾不断刺激，不仅肺泡巨噬细胞，肺组织间质细胞合成M M P 9 量也增加，细胞外基质被降解破坏，T I M P 一1 表达虽也增加，但酶的破坏能力超过了机体修复能力，从而导致肺气肿形成。近年研究表明，人类肺泡巨噬细胞与维甲酸共孵育后M M P 9 转录水平下降，T I M P 一1 转录水平
10、显著升高，外周血单核细胞也存在相似的效应【5 。肺脏是维甲酸的重要靶器官之一，存在大量的维甲酸受体。M a s s a r o 等【6 】发现A T R A 能逆转蛋白酶诱导的大鼠肺气肿模型，故此我们研究了其对更接近于人类发病机制的吸烟肺气肿大鼠模型的效应，发现维甲酸干预组肺泡平均面积、平均等效直径较模型组和药物对照组无显著性差异，而平均肺泡数增加，血气分析P a C 0 2 也有改善，提示其一定程度上减轻肺气肿，这与M a oJ T 等【7 研究发现一致。但是对于反应组织重建的敏感指标如M M P s ，我们发现A T R A 干预组肺泡巨噬细胞和肺组织M M P 一9 的m R N A和蛋
11、白表达水平下降，T I M P 1 表达水平明显增J J 口；I V 型胶原也有增加，提示全反式维甲酸可能通过调节M M P 一9 T I M P 1 平衡，阻止外周小气道组织结构的进步破坏，促进了肺泡修复。在以后研究中如果加大剂量或延长疗程，或者能有更明显的改善。在生理情况下，全反式维甲酸是维生素A 在体内的活性代谢产物，也华中科技大学同济医学院侦十W 究生毕业论文是维生素A 的一类活性最强的衍生物。主要通过与细胞核受体结合发挥作用，这种核受体属于固醇类受体超家族，包括维甲酸受体( R A R s ) 和维甲酸x 受体( R X R s ) ，核受体被配体激活后，主要是作为转录因子，与维甲酸
12、反应元件( R A R E ) 结合，调控靶基因转录活性，还可参与其它转录因子的调节，导致某些基因转录活性增强或抑制f8 1 。另外，维甲酸还有一定的抗炎效应，如下调粘附分子和细胞因子( I L 一1 等) ，对于C O P D 的治疗也有益。目前，维甲酸已成功用于治疗某些肿瘤( 如急性早幼粒细胞性白血病) 、皮肤病( 如银屑病、湿疹) 等，它们主要是激活了一系列与胚胎发育过程中相似的基因的表达，从某种角度讲，它是一种基因转录的调节性药物，提示着慢性阻塞性肺气肿的新的临床治疗方向，与单纯使用蛋白酶抑制剂相比，A T R A 同时下调M M P 一9 ，上调TI M P 一1 表达可能是一种治疗
13、C O P D的更有希望的方法。由于C O P D 的发病机制复杂，除蛋白酶抗蛋白酶平衡外，还有氧化抗氧化失衡等，有关A T R A 的进一步分子调节机制及用于临床治疗C O P D 等尚待进一步研究。兰! 型垡奎堂旦鲨匡堂堕竺里l 塑竺堂、业堡奎参考文献1 M a s s a r oG D ，M a s s a r oDP o s t n a t a lt r e a t m e n tw i t hr e t i n o i ca c i di n c r e a s e st h en u m b e ro fp u l m o n a r ya l v e o l ii nr a t
14、s A mJP h y s i o l ，1 9 9 6 2 7 0 ：L 3 0 5 一L 3 1 0 2 S h a p i r oS D E l a s t o l y t i cm e t a J I o p r o t e i n a s e sp r o d u c e db yh u m a nm o n o n u c l e a rp h a g o c y t e s ：p o t e n t i a lr o l e si nd e s t r u c t i v el u n gd i s e a s e A mJR e s p i rC r i tC a r e M
15、e d ，19 9 4 ，1 5 0 ：S 1 6 0 一S 1 6 4 3 V i g n o l aA M ，R i c c o b o n oL ，M i r a b e l l aA ，e ta lS p u t u mm e t a l l o p r o t e i n a s e 一9 t i s s u ei n h i b i t o ro fm e l a l l o p r o t e i n a s e 一1r a t i oc o r r e l a t e sw i t ha i r f l o wo b s t r u c t i o ni na s t h m
16、aa n dc h r o n i cb r o n c h i t i sA mJR e s p i rC r i tC a r eM e d ，1 9 9 8 ，1 5 8 ：1 9 4 5 1 9 5 0 4 S e g u r a - V a l d e zL ，P a r d oA ，G a x i o l aM ，e la l ，U p - r e g u l a t i o no fg e l a t i n a s e sAa n dB ，c o l l a g e n a s e s1a n d2 ，a n di n c r e a s e dp a r e n c h y m a lc e l ld e a t hi nC O P D C h e s t ，2 0 0 0 ，117 ：6 8 4 - 6 9 4 5 F r a n k e
