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1、1105 非无菌产品微生物检验方法 适用性试验 柴海毅 为什么要做方法适用性试验？ 与国际通用要求接轨 促进微生物检验定量化 推进微生物检验标准化 提升药品质量的要求 培养基适用性检查 范围： - 成品培养基（新引入概念） - 由脱水培养基制成的培养基 - 按处方配制的培养基 计数方法适用性试验： 实质：微生物计数方法验证。微生物计数方法验证。 几个数字要求： - 接种菌悬液的体积不大于供试液的1% - 菌悬液含菌量不大于100cfu - 抗菌或抑菌活性的标准：回收率低于50% 微生物测试方法 平皿法 1、倾注发； 2、涂布法、涂布法 薄膜过滤法 MPN法 涂布法 新引入的方法 关键点：涂布供
2、试液不少于0.1mL. 非无菌产品微生物限度检查： 控制菌检查法 培养基适用性检查 培养基促生长能力检查 分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。 培养基抑菌能力检查 分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。 检验方法适用性试验 实质：控制菌检验方法验证。控制菌检验方法验证。 适用性试验： 规定最短时间培养，试验菌检出能力试验。规定最短时间培养，试验菌检出能力试验。 供试品检查 规定最长时间下的控制菌试验。 验证目的 - 在于确认（寻找）一种有效的检验方法， 如果样品（药品）中有一定数量的微生物 存
3、在，那么采用此法可以使得样品（药品 ）中的微生物得以检出。 - 充分验证样品（药品）本身对微生物生长 的影响。 方法适用性试验的目的 确认一种检验方法。 验证实验 检验条件 检验方法 检验规程 样品量 稀释液种类 稀释液体积 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 SOP 影响微生物检验的因素 微生物检验的检出率很低下 样品/药品自身的特殊性 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 培养基的特性 培养条件 人员因素 实验器材的选择 恢复试验 微生物方法适用性试验的实质就是评价 和考察微生物恢复试验（恢复生长）的 可信度。 恢复试验就是确认某一检验方法，它可 以使加入其中的各种微生物都能够恢复 生长。 方
4、法适用性试验内容 （一）计数法适用性试验 （二）控制菌检验法适用性试验 微生物检验法适用性试验 （一） 计数法适用性试验 供试液制备 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效 性及对微生物的生长和存活无影响。 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1小时。 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45。 供试液的体积：100ml。 稀释剂： （1）0.1%无菌蛋白胨水溶液 （2）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 （3）0.9%无菌氯化钠溶液 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 计数法适用性检查菌种选择原则 普遍性 - G+、 G-、 -杆
5、菌（长、短杆菌） -球菌 -真菌（丝状真菌、酵母菌） 特殊性 - 从环境中分离出来的常见杂菌 - 从样品中分离出来的常见杂菌 计数法验证用菌株： 菌株名称 CMCC编号 培养条件 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B)10104 TSA培养基 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B)26003 30-35 不超过3天 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） CMCC(B)63501 白色年珠菌(Candida albicans) CMCC(F)98001 TSA培养基 30-35 黑曲霉菌(Aspergill
6、us niger) CMCC(F)98003 不超过5天 SDA培养基 20-25 不超过5天 计数法适用性检查步骤 选定一个方法 确定检测限 设计适用性检查方案 样品的选择 合格的样品 （1） 按照正常取样方法取样的样品 （2） 符合限度标准的样品 检测限：样品中细菌被检出的最低量。 平板法： 薄膜过滤法： 细菌 300 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 100 cfu/ml 细菌 50 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 50 cfu/ml 检测限设定依据 微生物计数原则 限度 / 标准 数理统计方法学的要求 恢复试验 恢复生长是指人为地添加的测试菌（污 染菌）在供试液中的生长水平 回收率则是测
7、试菌（污染菌）在样品供 试液中的存活率与测试菌污染菌的检出 率的比值 恢复试验的原则 消除样品的抑菌性 样品的处理方法和检验方法不应影响样 品中微生物的生长 如何消抑菌活性 稀释法 中和法 薄膜过滤法 组合运用 中国药典2015年版四部 样品本底含菌量高， 怎么处理？ 样品本底含菌量高 1、稀释：供试液梯度稀释 2、过滤：0.45 m滤膜过滤 中国药典2015年版四部 计数法适用性试验（平板法） 试验组： 样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 供试品对照组： 样品溶液（1/10）9.9ml 稀释液 0.1 ml（阴性对照） 菌液对照组： 104 102 （阳
8、性对照） 空白样品组： 计数A 计数B 计数C 计数D 结果判断依据 1、试验组和供试品对照组微生物计数结果吻合，表明： - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、供试品对照组和菌液对照组微生物计数结果吻合，表明： - 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性，表明： - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。 可以接受的标准 平板法 1、重现性良好 - 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效（微生物的回收率） - 阴性对照：无污染事件发生 - 样品组（ 回收率）：
9、 50200% 3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符 计数法的验证-各国药典结果判断标准 美国药典USP36规定微生物法验证中回收率： For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum。 对于固体培养基，获得的生长结果不得超过 由标准接种而来的计算值的两倍范围。 中国药典2015年版四部 中国药典2015年版四部 中国药典2015年版四部 不可以接受的标准（1） 1、阴性对照： 阴
10、性对照(包括供试品组和空白样品组) 发生污染事件。 菌落鉴别：- 污染菌是测试菌：检验员无菌操作培训。 - 污染菌不是测试菌：偏差调查。 2、阳性对照： 样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。 重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。 不可以接受的标准（2） 3、试验组： - 三人三次的试验结果应该与检测限相符。 - 第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的 试验证实。 - 任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程 有缺陷，验证需重新进行。 优化更新步骤： 消除抑菌活性。 稀释样品时，应确认检测限（检验限度） 低于或等于标准。 不同的细菌，一个
11、好的结果可以从不同的 稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于 日常的监测中。 平板法优化更新方法 稀释样品：1/10 1/50 1/100 增加培养基量 延长培养时间 添加抗活性剂 计数法适用性试验（薄膜过滤法） 试验组： 样品溶液（1/10）10ml 过滤 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 供试品对照组： 蛋白胨稀释液 10ml 过滤 （阴性对照） 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌液对照组： 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤 （阳性对照） 过滤 空白样品组： 计数A 计数B 计数C 计数D 可以接受的标准 薄膜过滤法 1、重现性良好 - 三批不同批
12、次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效（微生物的回收率） - 阴性对照：没有污染事件发生。 - 样品组： 50200% 3、样品的处理方法和检验方法与检 验规程相符 薄膜过滤法优化更新方法 增加冲洗量 增大样品稀释倍数（1/50，1/100） 延长培养时间 添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以） 微生物检验法适用性试验 （二） 控制菌检验法适用性试验 检验法适用性试验菌种选择原则 样品的给药途径和类型决定了采用何种 控制菌实施检验方法适用性试验。 增菌培养基的确定 增菌培养基的实际用量等同控制菌检查 法验证时的用量。 验证的开始。 检验法适用性试验 选定一个方法：CP或U
13、SP 设定检测限：不得检出 设计检验方法适用性试验方案 检验法适用性试验（平板法） （以大肠杆菌为例） 增菌 （计数） 样品组样品组 蛋白胨蛋白胨 对照对照 菌悬液菌悬液 对照对照 样品样品 100ml增菌液增菌液 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 100ml 增菌液增菌液 蛋白胨蛋白胨 0.1ml、1X102 cfu/ml 培培 养养 样品组样品组 空白样空白样 品对照品对照 检验法适用性试验（平板法） （以大肠杆菌为例） 确认 培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检， 必要时要鉴别。 4 组组
14、测试样品测试样品 观 察 CP法 USP法 18小时 24小时 结果判断依据 1、试验组和供试品对照组测试结果一致，表明： - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、供试品对照组和菌液对照组测试结果一致，表明： - 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性，表明： - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。 可以接受的标准 1、样品检验 - 增菌液经培养后明显浑浊 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 2、阳性对照 - 增菌液经培养后必须是浑浊的 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 3、阳性菌计数 - 菌悬液的计数结果应该 25 cfu/ml 不可以接受的标准 （无效试验） 1、样品检验 - 与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤 2、阳性对照 - 与可接受的标准不符 结
