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1、1105 非无菌产品微生物检验方法 适用性试验 柴海毅 为什么要做方法适用性试验? 与国际通用要求接轨 促进微生物检验定量化 推进微生物检验标准化 提升药品质量的要求 培养基适用性检查 范围: - 成品培养基(新引入概念) - 由脱水培养基制成的培养基 - 按处方配制的培养基 计数方法适用性试验: 实质:微生物计数方法验证。微生物计数方法验证。 几个数字要求: - 接种菌悬液的体积不大于供试液的1% - 菌悬液含菌量不大于100cfu - 抗菌或抑菌活性的标准:回收率低于50% 微生物测试方法 平皿法 1、倾注发; 2、涂布法、涂布法 薄膜过滤法 MPN法 涂布法 新引入的方法 关键点:涂布供
2、试液不少于0.1mL. 非无菌产品微生物限度检查: 控制菌检查法 培养基适用性检查 培养基促生长能力检查 分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。 培养基抑菌能力检查 分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。 检验方法适用性试验 实质:控制菌检验方法验证。控制菌检验方法验证。 适用性试验: 规定最短时间培养,试验菌检出能力试验。规定最短时间培养,试验菌检出能力试验。 供试品检查 规定最长时间下的控制菌试验。 验证目的 - 在于确认(寻找)一种有效的检验方法, 如果样品(药品)中有一定数量的微生物 存
3、在,那么采用此法可以使得样品(药品 )中的微生物得以检出。 - 充分验证样品(药品)本身对微生物生长 的影响。 方法适用性试验的目的 确认一种检验方法。 验证实验 检验条件 检验方法 检验规程 样品量 稀释液种类 稀释液体积 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 SOP 影响微生物检验的因素 微生物检验的检出率很低下 样品/药品自身的特殊性 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 培养基的特性 培养条件 人员因素 实验器材的选择 恢复试验 微生物方法适用性试验的实质就是评价 和考察微生物恢复试验(恢复生长)的 可信度。 恢复试验就是确认某一检验方法,它可 以使加入其中的各种微生物都能够恢复 生长。 方
4、法适用性试验内容 (一)计数法适用性试验 (二)控制菌检验法适用性试验 微生物检验法适用性试验 (一) 计数法适用性试验 供试液制备 表面活性剂、中和剂或灭活剂:应证明其有效 性及对微生物的生长和存活无影响。 供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过 1小时。 供试液制备若需用水浴加温时,温度不应超过 45。 供试液的体积:100ml。 稀释剂: (1)0.1%无菌蛋白胨水溶液 (2)pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 (3)0.9%无菌氯化钠溶液 固体:10g 供试品+稀释剂至100ml 液体:10ml供试品+稀释剂至100ml 计数法适用性检查菌种选择原则 普遍性 - G+、 G-、 -杆
5、菌(长、短杆菌) -球菌 -真菌(丝状真菌、酵母菌) 特殊性 - 从环境中分离出来的常见杂菌 - 从样品中分离出来的常见杂菌 计数法验证用菌株: 菌株名称 CMCC编号 培养条件 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B)10104 TSA培养基 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B)26003 30-35 不超过3天 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B)63501 白色年珠菌(Candida albicans) CMCC(F)98001 TSA培养基 30-35 黑曲霉菌(Aspergill
6、us niger) CMCC(F)98003 不超过5天 SDA培养基 20-25 不超过5天 计数法适用性检查步骤 选定一个方法 确定检测限 设计适用性检查方案 样品的选择 合格的样品 (1) 按照正常取样方法取样的样品 (2) 符合限度标准的样品 检测限:样品中细菌被检出的最低量。 平板法: 薄膜过滤法: 细菌 300 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 100 cfu/ml 细菌 50 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 50 cfu/ml 检测限设定依据 微生物计数原则 限度 / 标准 数理统计方法学的要求 恢复试验 恢复生长是指人为地添加的测试菌(污 染菌)在供试液中的生长水平 回收率则是测
7、试菌(污染菌)在样品供 试液中的存活率与测试菌污染菌的检出 率的比值 恢复试验的原则 消除样品的抑菌性 样品的处理方法和检验方法不应影响样 品中微生物的生长 如何消抑菌活性 稀释法 中和法 薄膜过滤法 组合运用 中国药典2015年版四部 样品本底含菌量高, 怎么处理? 样品本底含菌量高 1、稀释:供试液梯度稀释 2、过滤:0.45 m滤膜过滤 中国药典2015年版四部 计数法适用性试验(平板法) 试验组: 样品溶液(1/10)9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 供试品对照组: 样品溶液(1/10)9.9ml 稀释液 0.1 ml(阴性对照) 菌液对照组: 104 102 (阳
8、性对照) 空白样品组: 计数A 计数B 计数C 计数D 结果判断依据 1、试验组和供试品对照组微生物计数结果吻合,表明: - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、供试品对照组和菌液对照组微生物计数结果吻合,表明: - 中和剂没有毒性,没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性,表明: - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。 可以接受的标准 平板法 1、重现性良好 - 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效(微生物的回收率) - 阴性对照:无污染事件发生 - 样品组( 回收率):
9、 50200% 3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符 计数法的验证-各国药典结果判断标准 美国药典USP36规定微生物法验证中回收率: For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum。 对于固体培养基,获得的生长结果不得超过 由标准接种而来的计算值的两倍范围。 中国药典2015年版四部 中国药典2015年版四部 中国药典2015年版四部 不可以接受的标准(1) 1、阴性对照: 阴
10、性对照(包括供试品组和空白样品组) 发生污染事件。 菌落鉴别:- 污染菌是测试菌:检验员无菌操作培训。 - 污染菌不是测试菌:偏差调查。 2、阳性对照: 样品组的试验数据与检测限不符。(微生物的回收率过 高或过低)结论:样品组的试验结果无效。 重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。 不可以接受的标准(2) 3、试验组: - 三人三次的试验结果应该与检测限相符。 - 第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的 试验证实。 - 任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程 有缺陷,验证需重新进行。 优化更新步骤: 消除抑菌活性。 稀释样品时,应确认检测限(检验限度) 低于或等于标准。 不同的细菌,一个
11、好的结果可以从不同的 稀释度中检测出,最高的稀释度将被用于 日常的监测中。 平板法优化更新方法 稀释样品:1/10 1/50 1/100 增加培养基量 延长培养时间 添加抗活性剂 计数法适用性试验(薄膜过滤法) 试验组: 样品溶液(1/10)10ml 过滤 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 供试品对照组: 蛋白胨稀释液 10ml 过滤 (阴性对照) 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌液对照组: 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤 (阳性对照) 过滤 空白样品组: 计数A 计数B 计数C 计数D 可以接受的标准 薄膜过滤法 1、重现性良好 - 三批不同批
12、次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效(微生物的回收率) - 阴性对照:没有污染事件发生。 - 样品组: 50200% 3、样品的处理方法和检验方法与检 验规程相符 薄膜过滤法优化更新方法 增加冲洗量 增大样品稀释倍数(1/50,1/100) 延长培养时间 添加抗活性剂(冲洗剂里加也可以) 微生物检验法适用性试验 (二) 控制菌检验法适用性试验 检验法适用性试验菌种选择原则 样品的给药途径和类型决定了采用何种 控制菌实施检验方法适用性试验。 增菌培养基的确定 增菌培养基的实际用量等同控制菌检查 法验证时的用量。 验证的开始。 检验法适用性试验 选定一个方法:CP或U
13、SP 设定检测限:不得检出 设计检验方法适用性试验方案 检验法适用性试验(平板法) (以大肠杆菌为例) 增菌 (计数) 样品组样品组 蛋白胨蛋白胨 对照对照 菌悬液菌悬液 对照对照 样品样品 100ml增菌液增菌液 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 100ml 增菌液增菌液 蛋白胨蛋白胨 0.1ml、1X102 cfu/ml 培培 养养 样品组样品组 空白样空白样 品对照品对照 检验法适用性试验(平板法) (以大肠杆菌为例) 确认 培养结束后,需检查大肠杆菌菌落形态并镜检, 必要时要鉴别。 4 组组
14、测试样品测试样品 观 察 CP法 USP法 18小时 24小时 结果判断依据 1、试验组和供试品对照组测试结果一致,表明: - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、供试品对照组和菌液对照组测试结果一致,表明: - 中和剂没有毒性,没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性,表明: - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。 可以接受的标准 1、样品检验 - 增菌液经培养后明显浑浊 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 2、阳性对照 - 增菌液经培养后必须是浑浊的 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 3、阳性菌计数 - 菌悬液的计数结果应该 25 cfu/ml 不可以接受的标准 (无效试验) 1、样品检验 - 与可接受的标准不符 结论:重新设计试验步骤 2、阳性对照 - 与可接受的标准不符 结