《一个新的肺癌转移相关基因—LCMR1的克隆，序列分析，表达谱研究及其生物学功能的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一个新的肺癌转移相关基因—LCMR1的克隆，序列分析，表达谱研究及其生物学功能的初步研究（78页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国人民解放军军医进修学院硕士学位论文一个新的肺癌转移相关基因LCMR1的克隆，序列分析，表达谱 研究及其生物学功能的初步研究姓名：田庆申请学位级别：硕士专业：呼吸内科指导教师：陈良安;刘又宁2003.5.1摘要目的：通过m R N A 差异显示技术( D D R T - P C R ) 研究人高、低转移肺大细胞癌细胞系基因差异表达谱，克隆与肿瘤转移相关的基因，并初步探讨其生物功能及其在转移过程中的作用方法：应用H I E R O G L Y P Hm R N AP r o f i l eS y s t e m ( G e n o m y x ，F o s t e r ，C a l i f )
2、 系统对高、低转移人肺大细胞癌细胞系的m R N A 进行差异显示，切胶回收差异表达e D N A ，克隆测序后与N C B I 提供的G e n B a n k 数据库进行B l a s t 比对；选择一条合适的片段为起始，应用R A C E 技术克隆该基因的全长序列；应用N o r t h e r nB l o t t i n g 实验观察其在人类各种正常组织中的表达情况；通过构建L C M R l 与G F P 的融合载体，转染人类支气管上皮细胞，观察该基因的表达产物在细胞内的定位；最后通过构建L C M R l 与G S T 的原核表达载体，在大肠杆菌中表达该蛋白，为进一步研究该蛋白质
3、的功能打下了坚实的基础结果：获得差异表达c D M A5 0 条，其中已知功能基因1 8 条，未知功能基因1 6 条，D N A 来源1 6 条，E S T4 条：克隆到一条基因的全长，登陆到N C B I 的O e n B a n k数据库，并命名为L C M R I ；N o r t h e r nB l o t t i n g 实验显示其在多种实质性脏器中的表达较高；该基因的产物被初步定位到细胞浆；本研究还建立了L C M R l 稳定的原核表达系统及诱导表达的条件结论：人高、低转移肺大细胞癌细胞系的基因表达差异较大，转移的过程受基因的表达与调控的影响，应用D D R T - P C R
4、 技术找到了可能在肿瘤转移的过程中起作用的基因，有可能为肿瘤的诊断和治疗提供新的线索A b s t r a c tO b j e c t i v e ：T h ea i mo ft h ep r e s e ms t u d yw a st oc l o n en o v e lg e n e sr e l a t e dt om e t a s t a s i so fl u n gc a n c e l “ t h r o u g hd i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r et r a n s c r i p tP C R ( D D R
5、 T - P C R ) ，w h i c hw a sp e r f o r m e db e t w e e nh i g h - r a t ea n dl o w - r a t em e t a s t a s i sl a r g e - c e l ll u n gc a n c e rc e l ll i n e s M e t h o d o l o g y ：D D R T - P C Rw a sp e r f o r m e di nt w ol a r g e c e l ll u n gc a n c e rc e l ll i n e sw i t hd i f
6、f e r e n tm e t a s t a s i sa b i l i t yu s i n gH I E R O G L Y P Hm R N AP r o f i l eS y s t e m ( G e n o m y x ，F o s t e r , C a i i f ) D i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dc D N A sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d ，s e a r c h e da g a i n s tG e n B a n kd a t a b a s e B
7、e g i n n i n gf r o mas u i t a b l eE S T ，t h ef u l l - l e n g t hc D N Aw a so b t a i n e dv aR A C E N o r t h e mb l o t t i n gw a su t i l i z e dt or e v e a l t h ee x p r e s s i o np m f i l eo ft h en o v e lg e n e F u s i o np r o t e i no fG F Pa n dt h en e wg e n ew a sc o n s t
8、 r u c t e d ，t r a n s f e c t e di n t oh u m a nb r o n c h i a lc e l l s ，t h e ns u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o nb er e v e a l e du n d e rf l u r o - r M c r o s c o p y F u r t h e rf u n c t i o ni n v e s t i g a t i o nw a se n c o u r a g e da f t e rp r o k a r y o t i ce x
9、p r e s s i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e da n da l m o s tp u r ep r o d u c tw a so b t a i n e d R e s u l t s ：W eo b t a i n e d5 0d i f f e r e n t i a l l yd i s p l a y e dc D N A s ，i n c l u d i n g18f u n c t i o n - k n o w ng e n e s ，1 6f u n c t i o n - u n k n o w ng e n e s
10、 ，1 6g e n o m i cD N Af r a g m e n t sa n d4E S T s An o v e lf u l l - l e n g t hc D N AW a sg a i n e dt h r o u g hR A C E ，s u b m R t e dt oG e n B a n ka n dn o m i n a t e dL C M R I H i g he x p r e s s i o no f t h eg e n ew a so b s e r v e di nh u m a nh e a r t , k i d n e y ,m u s c
11、l e se ta 1 T h ep r o d u c t so fL C M R lw a sI o c a l i z 砌i nt h ec e l l u l a rp l a s m a T h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mo fL C M R lw a sc o n s t r u c t e d ，a n dc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e dt or e a c hah i g h e re x p r e s s i o nl e v e ro f L
12、 C M R lp r o d u c t 3第一章应用m R N A 差异显示技术( D D R T - P C R ) 研究人高、低转移肺大细胞癌细胞系基因差异表达谱肺癌是严重危害人类生命健康的常见肿瘤，发病率逐年上升在临床上，转移是包括肺癌在内的决大多数肿瘤治疗失败和死亡的原因肿瘤转移是一个极其复杂的多步骤的癌细胞和宿主之问相互作用的联系过程( F i d l e rI J ，1 9 9 9 ；H e c h tJ R ，1 9 9 8 ；C u l pL A ，L i nW C ，K l e i n m a nN R ，1 9 9 9 ) ，它涉及到原发肿瘤组织中异质细胞亚群的选择、肿
13、瘤细胞黏附性和运动性，血管生成等多种肿瘤细胞的生物学行为( S o n eS ，1 9 9 9 ；K a m e iT ，1 9 9 9 ；V o r a v u dN ，1 9 9 9 ：吴松泉，1 9 9 9 ；B o h l eA S ，1 9 9 9 ) 而这些生物学行为是受特定基因调控的，肿瘤转移发生的过程从分子生物学角度来理解可以概括为转移相关基因的表达一转移表型一转移形成其中转移相关基因的表达是这个过程的启动部分，也是肿瘤转移发生发展的核心m R N A 差异显示技术( m R N Ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y 。D D - P C
14、R ) 是L i a n g 和P a r d e e于1 9 9 2 年建立的一种分离差异表达基因的方法( L i a n gP ，1 9 9 2 ) 其基本原理是将遗传背秉相同的2 种或者多种细胞系或组织m P , N A 逆转录为c D N A ，用不同的引物对( 锚定引物和随机引物) 进行P C R 扩增，测序胶电泳将P C R 产物进行分离，应用放射自显影或荧光素标记显影的方法找到差异表达基因的扩增片段我们应用H I E R O G L Y P Hm H N AP r o f i I tS y s t e m ( G e n o m y x ，F o s t e r ，C a l i
15、 f ) 系统对高，低转移人肺大细胞癌细胞系的m R N A 进行差异显示，切胶回收差异表达c D N A ，克隆测序后获得差异表达e D N A5 0 条，与N C B I 提供的O e n B a n k 数据库进行B i a s t 比对，试图分高与肺大细胞癌转移相关的基因第一节细胞培养及P , N A 提取人高、低转移肺大细胞癌细胞系9 5 D 和9 5 C 是解放军总医院陈乐真教授等在8 0 年代建立起来的两个细胞系，研究证实这两株细胞系在生物学行为、基因表达方面有较多的差异，侧如：接种裸鼠实验显示高转移肺大细胞癌细胞系9 5 D 较低转移肺大细胞癌细胞系9 5 C 的转移发生早，转
16、移灶数量多，体积大等但是它们的遗传背景是相同的，因此适合作为D D R T P C R 的研究对象，用于转移相关基因的筛选在细胞培养的过程中，我们观察到9 5 D 细胞较9 5 C 细胞生长快，细胞成类圆型，传代的时间短，细胞易于脱落，不应用胰酶亦能将其吹打下来9 5 C 细胞贴壁紧密，细胞成三角状，分支状上述观察到的结果提示，9 5 D 细胞易于脱落和转移，从另一个侧面说明这两株细胞之间在转移能力上有着明显的不同，它们是合适的D D R T - P C R 研究的对象材科：1 人高、低转移肺大细胞癌细胞系9 5 D 和9 5 C 由解放军总医院陈乐真教授惠赠2 R P M l l 6 4 0 培养基、P B S 及1 0 小牛血清购自I n v i t r o g e n 公司3 胰酶购自S i g m a 公司4 培养瓶购自C o m i n g 公司t 5 T r i z 0 1 试剂购自I n v i t r o g e n 公司6 异丙醇、氯仿及乙醇购自北京试剂公司方法：1 细胞
