《子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织FHIT基因表达及杂合性缺失研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织FHIT基因表达及杂合性缺失研究（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学硕士学位论文子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织FHIT基因表达及杂合性缺失研 究姓名：石海燕申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：陈晓端2003.5.12 0 0 3 年浙江大学硕士学位论文子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织F I I I T 基因的表达及杂合性缺失研究浙江大学医学院妇产科学2000 级硕士研究生石海燕导师陈晓端主任医师摘要， J 世界范围内，宫颈癌发病率和死亡率居女性恶性肿瘤的第二位。在我国，每年平均新发宫颈癌病例有1 3 1 5 万，而且近年来发病有年轻化趋势。因此，宫颈癌的早期诊断一直广受关注。子宫颈上皮内瘤变( C I N ) 已公认为富颈癌的癌前病变。然而，仅有其中的
2、一部分会经长期演进最终发展为宫颈癌，大部分C I N 可持续存在，甚至自然消退。单纯形态学检查往往无法确定C I N 的预后倾向，随着分子生物学的进展，寻找有助于宫颈癌早期诊断的分子学指标正成为研究热点。大量研究证实了高危型H P V 感染在宫颈癌发生中起重要作用，同时也提示单纯H P V 感染尚不足以引起宫颈癌，还需要其它分子事件的共同参与。抑癌基因的缺失或失活就是一个重要的发生机制。肿瘤等位基因缺失的检测分析为揭示肿瘤抑制基因提供了有效研究手段。分子遗传学研究发现富颈癌及部分癌前病变在3号染色体短臂3 p 1 4 2 1 区域存在高频率的等位基因缺失，提示该区域存在与宫颈癌发生、发展相关的
3、抑癌基因。脆性组氨酸三联体( F I I T ) 基因是近年发现的定位于3 p 1 4 2 区域的候选抑癌基因，研究发现人类许多恶性肿瘤，尤其是和环境致癌因素关系密切的恶性肿瘤中存在较高频率的F H I T 异常。国外学者对F H I T 基因在宫颈癌及C I N 中的转录和表达进行了研究，然而对F H I T 基因在宫颈癌发生发展中扮演的角色至今尚无定论。富颈癌F H I T 基因改变与表达之间的关系，F H I T基因失活的机制也少见有探讨。y本研究应用显微切割技术准确提取宫颈癌及C I N 发展各阶段病变细胞，采用免疫组化、杂合性缺失分析的方法检测候选抑癌基因F H I T 基因在宫颈癌
4、及C I N组织中的基因改变及表达的规律，探讨F H I T 基因在宫颈癌发病中的作用，以期I2 0 0 3 年新江大学硕士学位论文为宫颈癌的早期诊断和C I N 恶性潜能的评估提供线索和依据。防法 l L选取浙江大学医学院附属妇产科医院2 0 0 0 年1 月一2 0 0 1 年1 2 月间存档蜡块共1 1 3 例，包括5 6 例宫颈癌和5 7 例富颈上皮内瘤变。宫颈癌包括鳞癌4 2 例、腺癌1 4 例。宫颈上皮内瘤变包括C I NI1 5 例、C I NI I8 例、C I NI I I3 4 例。所有病例术前均未接受放疗或化疗。采用免疫组织化学染色( S P 法) 检测F H I T 蛋
5、白的表达。显微切割分离肿瘤组织，以同一病例正常组织为对照，选取2 个微卫星多态性位点D 3 S 1 3 0 0 和D 3 S 1 2 3 4 ，通过P C R 一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一银染法进行b H I T 基因杂合性缺失分析。结果1 子宫颈癌及C I N 组织F H I T 蛋白的表达：5 6 例宫颈癌中3 2 例F H I T 蛋白表达较正常粘膜显著减弱或缺失，低表达率5 7 $ 。6 9 ( 2 9 4 2 ) 的鳞癌和2 1 ( 3 1 4 )的腺癌组织F H I T 蛋白表达减弱或缺失，鳞癌组低表达率显著高于腺癌组( 足0 0 1 ) 。鳞癌组F H I T 蛋白低表达见于7 0
6、 9 6 ( 7 1 0 ) 的I 级癌、6 8 ( 1 3 1 9 )的I I 级癌和6 9 ( 9 1 3 ) 的I I I 级癌；F I G O 分期I 期、I I 期的F H I T 低表达率分别为7 5 ( 1 8 2 4 ) ，5 5 $ ( 6 1 1 ) ，F H I T 蛋白表达水平与鳞癌分化程度及患者F I G O 分期均未见明显相关性( p O 0 5 ) 。5 7 例C I N 中1 3 倒表达较正常减弱或无表达，低表达率2 3 ，显著低于浸润性鳞癌组的6 9 ( P 0 0 5 ) F o u r t e e no f5 7 ( 2 5 ) C I N ss h o
7、w e dL O Ha tl e a s ta to n el o c u s ，w i t has i g n i f i c a n t l yl o w e rf r e q u e n c yt h a ni n v a s i v es q u a m o u sc a r c i n o m ar P 5 0 为3 分。两者分值相乘得各例综合评分：评分0 分判为表达缺失，评分1 - 3 分判为表达减弱，量4 分判为正常表达。( 二) 杂合性缺失分析1 石蜡切片及显微切割肿瘤所在石蜡包埋组织做6 岬连续切片，贴于清洁载玻片上，将连续切片2 0 0 3 年浙江大学硕士学位论文的中间一张
8、进行H E 染色，作为形态观察之用。其余切片常规脱蜡水化后放入1 甲基绿中染色3 0 s e c ，双蒸水漂洗后自然干燥。将切片放在显微镜载物台上，找到切割目标组织，1 0 倍镜下手持清洁手术刀片在要切割的癌巢或C I N 区域周围来回刻划并使之与玻片分离。然后用蘸有微量裂解液( 5 0 I I 】MT r i s H c lP H8 5 ，5 m ME D T A ，0 1 T w e e n2 0 ) 的移液器枪头小心与游离的细胞接触，再用枪头将粘附其上的细胞转移到装有5 0 - 1 0 0 1 I 裂解液的E p p e n d o r f 管中。选取同一病例的正常宫颈组织或子富内膜组织
9、作为正常对照，石蜡切片常规脱蜡水化自然干燥后无需显微切割，直接用刀片刮下，放入装有裂解液的管中即可。2 D N A 模板的制备向上述样本中加入蛋白酶K 至终浓度2 0 0ug m 1 ，3 7 “ C 消化过夜。8 0 0 0 9 短暂离心后，P C R 仪中加热9 8 “ Cxl O m i n 灭活蛋白酶K 即可作为D N A 模板。“。3 P C Ra 2 5 - m 反应体系组成如下：1 0 P C RB u f f e r2 5 山P r i m e r11L L l ( 1 2 5 p m 0 1 )P r i m e r21L l l ( 1 2 5 p m 0 1 )d N T
10、 P0 5 u | ( 各2 0 0 u m o l L )T a qD N A 聚合酶0 2 山( 1 u )模板D N A卜2 ld d H 2 0加至2 5 I _ t Ib P C R 程序：采用热启动( h o ts t a r t ) 技术蚴，即在模板加热变性打开双链后再加入T a qD N A 聚合酶。D 3 S 1 2 3 4 ：9 4 5 m i n 一加入T a qD N A 聚合酶9 4 5 0 s、5 6 5 0 s卜3 2 c y c l e s7 2 5 0 sj7 2 1 0 m i n2 0 0 3 年浙江大学硕士学位论文D 3 S 1 3 0 0 ：9 4 “
11、 C5 m i n 一加入T a qD N A 聚合酶9 4 5 0 s、15 7 5 5 s卜3 5 c y c l e s7 2 5 5 sj7 2 l O m i nc P C R 产物分析：取5 mP C R 产物加入1 m 上样缓冲液( 0 2 5 溴麝香草酚兰，0 2 5 - - 甲苯青F F ，4 0 9 6 蔗糖) ，充分混匀后上样于含O 5 溴化乙锭的2 琼脂糖凝胶中，电泳缓冲液为0 5 x T B E ，l O V c m 电压下电泳3 0 r a i n ，紫外灯下观察明确目的条带的存在和无非特异性条带。4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳a 清洗、干燥制胶用的玻璃板，搭好模具b
12、配制8 变性聚丙烯酰胺凝胶( 含8 M 尿素) l O m l4 0 聚丙烯酰胺溶液( 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺为1 9 ：1 )2 m l尿素4 8 95 X T B E2 m l1 0 过硫酸铵7 0 山T E M E D1 0 山d d H 2 0加至l O m lc 用大号移液器将混合液缓慢注入模具的两玻璃板间，直至灌满模具顶部，立即插入加样梳，全过程注意勿使产生气泡。d 室温下聚合4 0 6 0 m i n ，梳齿下方出现S c h l i e r e n 线时，小心取出梳子，立即用去离子水冲洗梳孔，尽量去除来聚合的丙烯酰胺。e 将凝胶放入盛有1X T B E 的电泳槽中，1 5 0
13、 V 预电泳2 0 m i nf 取3 5 mP C R 产物与变性上样缓冲液( 9 8 去离子甲酰胺，0 2 5 溴麝香草酚兰，0 2 5 - - 甲苯青F F ) 等体积混合，9 5 热变性l O m i n ，立即置冰上骤冷3 m i n 后上样。g 1 I O V 电泳2 - 5 小时，取出玻璃模具，小心剥下凝胶，准备染色。5 D N A 染色( 银染法) 嘲1 42 0 0 3 年浙江大学硕士学位论文a 将凝胶在1 0 乙醇中固定l O m i n ，d d H ：0 漂洗两次，每次5 m i nb 1 蛳肖酸中分色5 m i n ，d d H ：0 漂洗3 次，每次5 m i nC
14、 0 0 1 2 m o l L 硝酸银溶液中染色l O m i n ，d d H , O 漂洗5 - 1 0 sd 加入预冷的显色液( 无水碳酸钠3 9 ，4 0 甲醛0 1 5 m l ，硫代硫酸钠2 0 01 2g ，加水至l O O m l ) ，观察到样品信号为棕褐色，凝胶背景呈透明淡黄色时，放入1 0 乙酸中终止显色。e d d H ：0 漂洗，薄膜封存，自然干燥后保存。6 结果判断杂合子型个体中，肿瘤组织与相应正常组织对比，肿瘤的某一等位基因条带消失或相对密度减少5 0 以上判断为杂合性缺失。“。( 三) 统计分析采用S P S S l l 0 统计软件，按不同临床病理指标进行分
15、组，各组间率的比较采用x2 检验及F i s h e r s 精确概率法检验。采用双侧检验，检验水准为a = O 0 5 。结果一子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织F H I T 蛋白表达正常子宫颈鳞状上皮、宫颈内膜腺上皮以及肿瘤间质细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞等均呈中一强的胞浆着色。5 6 例浸润癌中2 4 例( 占4 3 ) 与正常粘膜表达相当或增强，1 9 例表达减弱，1 3 例无表达，低表达率5 7 。不同组织学类型比较：4 2 例鳞癌中1 6 例F H I T 蛋白表达下降，1 3 例无表达，低表达率6 9 ：1 4 例腺癌中仅3 例表达下降，占2 1 。鳞癌组显著高于腺癌组( ，如
16、0 1 ) 。鳞癌组进一步按组织学分级比较：F H I T 蛋白低表达见于7 0 的I 级癌；6 8 的II 级癌；6 9 的I I I 级癌，不同组织分级间表达无显著性差异( 伶0 0 5 ) 。按F I G O 分期比较：F H I T 蛋白低表达在I 期占7 5 ，I I 期5 5 ，组间差异无显著性( 厣O 0 5 ) 。子宫颈癌F H I T 表达与临床病理特征的关系见表2 。5 7 例c I N 标本4 4 例与正常粘膜表达相当；1 3 例较正常减弱或无表达，低表达率2 3 ，显著低于浸润性鳞癌组的6 9 ( 尸 O 0 1 ) 。C I NI ，I I ，I I I 组的低表达率分别为7 ( 1 1 1 5 ) 、1 3 ( 1 8 ) 、3 2 ( 1 1 3 4 ) ，随病变级别升高低表达率呈现上升趋势。C
