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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：装永彼日期：训7学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文
2、被查阅和借阅。( 保密论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：保 密期限为年。学位论文作者签名：蔓拳破日期：训心芘7指导教师签名：侥屯跫一日期：。臼j 、”7 目录目录 摘要IA b s t r a c t I I 第一章绪论1 1 1 研究背景1 1 1 1 蓝藻水华1 1 1 2 痕量金属的地球化学循环1 1 1 3 痕量金属污染现状一2 1 1 4 浅水湖泊金属污染水体和沉积物微生物的群落结构变化3 1 2 重金属地球化学循环及其生物有效性的研究方法31 2 1B C R 法提取不同形态重金属31 2 2I C P M S 测定金属形态4 1 2 3 微生物
3、群落研究的分子生态学方法4 1 2 4 本研究主要采用的分子生物学方法9 1 2 5 本研究的主要内容、技术路线9 第二章微囊藻水华消亡对水体及沉积物中重金属形态含量及微生物T - R F L P 的 分析1 3 2 1 前言1 3 2 2 材料与方法1 3 2 2 1 采样点样品的采集1 32 2 2B C R 法提取沉积物中不同形态金属。1 42 2 3I C P - M S 测定重金属含量1 4 2 2 4 水样中细菌基因组D N A 的提取1 6 2 2 5 沉积物中细菌基因组D N A 的提取1 72 2 6T - R F L P 分析1 72 2 7T - R F L P 数据分析
4、处理2 0 2 。2 。8 细菌种群组成及变化的参数2 0 2 2 9 细菌群落结构相似性分析2 1 2 3 结果与分析2 1 2 3 1 微宇宙体系水体及重金属理化指标的变化2 1 2 3 1 微宇宙体系微生物群落结构T - R F L P 分析2 8 2 3 3 微宇宙体系细菌群落结构多样性指数分析3 3 2 4 小结3 6 第三章构建克隆文库研究微宇宙体系细菌群落结构的变化3 7 3 1 前言3 7 3 2 材料与方法3 7 3 2 1 克隆文库所需片段的准备3 7 3 2 2 克隆建库和测序3 8 3 2 3 测序结果的处理和分析3 9 3 3 实验结果4 0 3 3 1 克隆文库的构
5、建和阳性克隆的筛选4 0 3 3 2 测序结果与已知序列的对比结果4 0 3 3 3 克隆文库与T - R F L P 方法分析结果的比较4 6 3 4 小结4 6目录第四章结论与展望4 8 4 1 研究的结论4 8 4 2 本研究的创新之处4 8 4 3 研究展望4 9 参考文献5 0 参与课题和发表论文5 3 致 射5 4缩略语表缩略语表：A b b r e v i a t i o n s ：D N A d e s o x y n u c l e i ca c i d ；脱氧核糖核酸P C R p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ；聚合酶
6、链式反应r D N A r i b s o m a ld e s o x y n u c l e i ca c i d ；核糖体脱氧核糖核酸r R N A r i b o s o m a lR N A ；核糖体核糖核酸S D S s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ；十二烷基硫酸纳S S C P - s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ；单链构象多态性R A P D r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o
7、r p h i cD N A ；随即扩增多态性D G G E d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ；变性梯度凝胶电泳T G G E t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ；温度梯度凝胶电泳C A R D F I S H c a t a l y s e dr e p o r t e rd e p o s i t i o n F I S H ；酶联荧光原位杂交T - I 心一t e r m i
8、n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ；限制性片段T - R F L P t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ；末端限制性片段长度多态性X - G a l 一5 - b r o m o 4 一c h l o r o 一3 - i n d o l y l 一1 3 - D g a l a c t o p y r a n o s i d e ；5 一溴一4 氯3 - 吲哚B D 半乳糖苷A m p a m p i c
9、i l l i n ；氨苄青霉素b p b a s e p a i r s ；碱基对C y 5 一i n d o d i c a r b o c y a n i n e ；吲哚二碳菁染料E D T A e t h y l e n ed i a m i n et e t r a e e t i ca c i d ；乙二胺四乙酸F I S H f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ；荧光原位杂交I P T G i s o p r o p y l t h i o p - D g a l a c t o s i d e ；异丙
10、基硫代D D 半乳糖苷N C B I T h eN a t i o n a lC e n t e rf o rB i o t e c h n o l o g yI n f o r m a t i o n ；美国国立生物技术信息中心O T U o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ；操作分类单位R A R e l a t i v ea b u n d a n c e ；相对丰度摘要摘要淡水湖泊中，富营养化导致的蓝藻水华频繁暴发，严重削弱了湖泊的生态功能。蓝藻水华对湖泊中细菌群落结构和功能产生重要的影响。在重金属污染的湖泊中，蓝藻水华会富集水体
11、中的重金属。蓝藻消亡过程中，蓝藻释放出重金属，重金属进入水体中，从而影响湖泊环境中微生物的群落结构组成。目前，重金属对湖泊中细菌群落结构和功能的影响特征和作用机制尚不完全清楚。本研究构建微宇宙体系模拟蓝藻水华消亡后重金属对体系中微生物群落结构的影响。采用分子生物学技术限制性末端片段多态性分析细菌群落组成和动态变化，采用构建细菌的核糖体1 6 S r D N A 基因文库的方法，分析微宇宙体系中细菌群落主要的建种群。同时运用克隆建库和T - R F L P 的方法研究细菌的种群组成和基因多样性，对其中的主要种类进行系统发育分析。采用非加权组平均法对各样品的T - R F L P 图谱进行聚类分析
12、。结果显示添加了吸收C d 的蓝藻处理组水体细菌的群落结构与其它两组存在显著差异，而添加了吸收C d 的蓝藻处理组沉积物细菌的群落结构与其它两组存在显著差异。此外，构建温度梯度微宇宙体系并进行T - R F L P 分析发现，2 5 。C 条件下，添加吸收C d蓝藻处理组水体细菌的群落结构与其它温度的差异显著。对各样品的细菌多样性指数进行分析发现，添加了吸收C d 的蓝藻处理组水体和沉积物细菌的多样性要比其他两组的低。选取部分样品构建克隆文库，共获得个2 2 7 个1 6 S r D N A 基因序列。通过与G e n B a n k 中已有序列的比对( b l a s t ) ，发现样品中细
13、菌的主要类群为：变形菌( P r o t e o b a c t e r i a ) 的0 【- 、p 亚纲( a l p h a - ，b e t a ，a n dg a m m a s u b d i v i s i o n ) 、聚球蓝细菌( S y n e c h o c o c c u s ) ，放线菌( A c t i n o b a c t e r i a ) 、拟杆菌( B a c t e r i o d e t e s ) 、浮霉菌( P l a n c t o m y c e t e s ) 。对各主要类群所占比例分析，B P r o t e o b a c t e r i a 所占的比例最高，为5 9 4 7 ，0 c P r o t e o b a c t e r i a ( 1 4 5 4 ) 次之；其次依次是拟杆菌门( B a c t e r o i d e t e s ) ，占“8 9 ；硬壁菌门( F i r m i c u t e s ) ，占8 3 7 ；放线菌门( A c t i n o b a c t e r i a ) ，占1 7 6 ；其他菌种所占比例很少。综上，T R F L P 和构建1 6 Sr R N A 克隆文库有助于分析重金属对细菌群落结构的影响特征，获得的结果有助于进一步认识重金属导致的湖泊生
