湖北中医学院硕士学位论文女贞子抗肿瘤活性成分研究姓名：但红申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：谭文界2003.6.1中文摘要目的：女贞子抗肿瘤抗病毒活性已受到国内外广大临床工作者的高度重视，但对其有效成分尚不完全清楚，本实验目的为探讨女贞子抗肿瘤活性成分．f 方法：对女贞子的乙醇提取物进行柱层析分离和重结晶纯化，通、过理化方法和测定I R 、M S 、‘H —N M R 、”C - N M R 鉴定得到的化合物．采用电子显微镜和荧光染色等实验技术研究活性成分在体外对舌癌细胞的诱导凋亡作用．结果：女贞子的乙醇提取物中分离纯化得到三种结晶( c ，、C ：、C 3 ) ，鉴定其依次为熊果酸、齐墩果酸、萎陵菜酸其中熊果酸显示明显的抑癌活性，实验发现发现：熊果酸和舌癌细胞共同孵育2 4 h 后出现典型的凋亡形态改变熊果酸能抑制舌癌细胞生长，且量效关系明、 显L／结论：熊果酸是女贞子具有抗肿瘤活性的主要成分之一主题词：女贞子? 熊果酸：抗肿瘤义凋亡xA B S T R A C TO B J E C T I V E ：T oS t u d yt h ea n t i c a n c e rc o n s t i t u e n to fF r u c t u sL i q u s t r il u c i d iM E T H O D S ：S i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a se m p l o y e df o rt h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ．T h es t r u c t u r e so ft h ec o m p o u n d sw e r ee l u c i d a t e db ym e a n so fI R ，M S ，1 H - N M R 、n C ．N M Ra n dc h e m i c a lm e t h o d s ．M e a n w h i l e ，a p o p t o s i si n d u c e db yU r s o l i ca c i di nT o n g u es q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ( T S C C a ) w a st e s t e db ym i c r o s c o p ea n df l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ．R E S U L T S ：T h r e ec o m p o u n d sw e r eo b t a i n e da n di d e n t i f i e da sU r s o l i ca c i d ，O l e a n o l i ca c i da n dT o r m e n t i ca c i dr e s p e c t i v e l y ．A m o n gt h e mU r s o l i ca c i ds h o w e dam a r k e d l yi n h i b i t o r ye f f e c to nT S C C a ．W h e ni n c u b a t e dw i t hu r s o l i ca c i df o r2 4 h ，T S C C as h o w e dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e sa s s o c i a t e dw i t ht h ec h a r a c t e r so fa p o p t o s i s ，U r s o l i ca c i dr e d u c e dT S C C ag r o w t hi nac o n c e n t r a t i o n ．d e p e n d e n tm a n n e r ．C O N C L U S I O N ：u r s o l i ca c i dc o u l dt h em a i na n t i c a n c e rc o n s t i t u e n to f F r u c t u sL i g u s l r il u c i d i ．K E YW O R D S ：F r u c t u sL i g u s t r il u c i d i 、U r s o l i ca c i d 、A I n i c a n c e r 、A p o p t o s i s．4第二部分文献综述女贞子F r u c t u sL i g u s tr il u c i d i 系木犀科植物女贞的干燥成熟果实，是我国传统的扶正固本药物，具有养阴气、平肝火、补腰膝，壮筋骨、滋补肝肾、乌须发等功效。
早在《神农本草经) ) 就记载：“女贞实，味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病临床应用已有二千多年的历史现代药理研究表明，女贞子具有多种药理活性1 ．对免疫系统的作用包括：增强免疫器官重量、增强体液免疫功能、提高细胞免疫功能、升高外周白细胞数、增强网状内皮系统的吞噬功能、抑制变态反应；2 ．对血液与造血系统的作用包括：促进造血功能、护肝作用、抗血卟啉衍生物光氧化作用；3 ．对物质代谢的影响：降血糖、降血脂；4 ．激素样双向调节作用；5 ．抗炎抑菌作用；6 ．抗衰老；7 ．对染色体损伤的保护作用；8 ．降低眼压等“1 女贞子在临床上多用于白细胞减少症、乙型肝炎、高血脂症、冠心病、青光眼、糖尿病近年来，对女贞子抗肿瘤作用的研究越来越受到国内外学者的重视2 ．1 女贞子的化学成分研究据文献研究，国内外学者从女贞子中分离了多种化学成分：齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸、乙酰熊果酸、甘露醇、c 【一乌索酸甲酯、萎陵菜酸1 、2 仅一羟基一3D 一反式对羟基肉桂酰氧基齐墩果酸、芹菜素、槲皮素”1 、特女贞甙、女贞苦甙“1 、达玛一2 4 一烯一3p 一乙酰氧基一2 0 s 一醇、女贞酸”3 、对羟基苯乙醇一D —D 一葡萄糖甙、对羟基苯乙醇一G 【一D - 葡萄糖甙、齐墩果酸的盐“1 ，还含有由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、岩藻糖组成的多糖”1 ，及总量为0 ．3 9 ％的7 种磷脂类化合物“3 、多种脂肪酸”’、挥发油“⋯、微量元素⋯3 等。
以下是部分化合物的结构式：2o 【一羟基- 3D 一反式对羟基肉桂酰氧基齐墩果酸特女贞甙女贞苦甙女贞酸达玛一2 4 一烯- 3D 一乙酰氧基一2 0 一酵≮寥2 ．2 女贞子抗肿瘤活性成分药理研究国内外学者对女贞子提取物的抗肿瘤作用研究发现，女贞子抗肿瘤活性成分为三萜酸类物质，即熊果酸和齐墩果酸，其中熊果酸的抗肿瘤作用尤为突出二者抗肿瘤作用机理为：抑制肿瘤增殖、抗肿瘤侵袭、诱导凋亡、抑制血管生成、降低癌基因表达、提高机体免疫功能、降低照射后造血器官损伤等2 ．2 ．1 抑制肿瘤细胞增殖熊果酸与齐墩果酸抑制佛波醇二酯( T P A ) 诱导的E B 病毒活化，它们抑制小鼠皮肤癌的活性与维甲酸相当“”熊果酸显著抑制体外培养的人肿瘤细胞生长，如A - 5 4 9 ，S K - O V - 3 ，S K - M E L - 2 ，X F 4 9 8 和H C T l 5 “”熊果酸显著抑制小鼠黑素瘤细胞系B 1 6 增殖，对细胞周期的G ，期产生作用“”K o m i y a 等发现熊果酸和齐墩果酸抑制M o lt 4 B 细胞增殖体外实验中熊果酸抑制鸟氨酸脱羧酶( O D C ) 活性，浓度在l m M 和2 r a m 时分别为2 5 ．9 ％、3 9 ．7 ％。
齐墩果酸的抑制程度比熊果酸小，熊果酸和齐墩果酸还能轻微抑制s 一腺瞽甲硫氨酸脱羧酶( A d o M e t D C ) 活性，减少多胺释放“”E S —S a a d y 等研究发现熊果酸与齐墩果酸抑制人胃癌细胞( H O T )增殖，并呈剂量相关性，齐墩果酸的抑制作用比熊果酸弱位上羧基与抑制作用有关，该基因甲基化后抑制作用降低n 6 1 D N A 拓扑异构酶主要分为I 、Ⅱ型，是控制D N A 超螺旋水平重要的酶，涉及到D N A 代谢的多个生理过程，熊果酸的抗癌活性可能与抑制拓扑异构酶I I 的催化作用( 即链形的K D N A 断裂) 有关I i d a 等认为熊果酸碳架结构与抑制拓扑异构酶1 1 的关系是：碳链至少有1 4 个一c H ：一，碳碳双键比单键活性低此外，熊果酸结构上3p —O H 对抑酶活性有消极影响，事实上熊果酸的脱氧产物活性显著增强，c ：s 位上的羧基是具备抑酶活性的基本条件，化合物的亲脂性有助于增强抑酶活性⋯1 熊果酸通过抑制酪氨酸激酶产生抗儿，细胞增殖作用熊果酸能显著抑制九，，细胞生长，并与时间、浓度有相关性，5 0 m m 的熊果酸细胞毒活性最强熊果酸抑制乜，，细胞酪氨酸激酶活性的作用与浓度有相关性，半抑制浓度( I C ；。
) 为2 4g t M ，用不同浓度的熊果酸预处理凡，，细胞2 4 、4 8 、1 6 8 小时，发现I c ，降低了：2 4 h 为6 ．8uM ，4 8 h 为5 ．2 “M ，1 6 8 h 为1 ．4uM ““2 ．2 ．2 抗肿瘤侵袭细胞外基质的降解是肿瘤细胞迁移，浸润基质的前提，基质金属蛋白酶( M M P s ) 在肿瘤的侵袭和演进中起重要作用c h a 等研究发现熊果酸通过显著下调明胶酶B ( M M P - 9 ) 的表达，而具有抗H T ，人纤维瘤细胞系侵袭活性“”由于熊果酸的化学结构与糖皮质激素地塞米松相似，二者均能降低M M P - 1 、M M P 一3 和M M P - 9 表达，因此研究了熊果酸下调i M P 一9 的作用机制与糖皮质激素受体的关系西方吸印技术和免疫细胞化学技术显示熊果酸增加核内糖皮质激素受体，糖皮质激素受体对抗物R U 4 “可拮抗熊果酸下调M M P - 9 的作用提示熊果酸可能通过激活糖皮质激素受体，发生易位后下调A P - 1 对M M P 一9 启动子的作用“⋯2 ．2 ．3 诱导凋亡显微镜分析显示，熊果酸处理的肿瘤细胞出现核染色质浓缩，D N A核小体断裂成碎块等典型的细胞凋亡形态改变。
熊果酸诱发肿瘤细胞凋亡与多种因素有关：2 ．2 ．3 ．I 钙离子c a “作为信号转导系统的第二信使，在细胞凋亡过程具重要作用，细胞凋亡发生时胞质内c a 2 + 浓度显著上升，B a e k 等用H L - 6 0 细胞为模型检测熊果酸诱导细胞凋亡的作用，熊果酸处理使胞质内c a2 + 浓度上升，胞质内c a ”抑制剂( 硝苯呋海因、T M B - 8 、钉红) 吸螯合剂( B A P T A ／A M )均明显阻断熊果酸引起的胞质内c a “浓度升高，并阻断熊果酸诱导细胞凋亡作用提示熊果酸诱导的1 1 L - 6 0 细胞凋亡可能与胞质内C a 2 秸使有关n ”2 ．2 ．3 ．2 环腺苷酸( c A M P )c A M P 通过激活依赖c A M P 的蛋白激酶( P K A ) 催化蛋白质磷酸化反应，具有抑制肿瘤细胞增殖作用c h o i 等通过分析熊果酸诱导的H L 一6 0 细胞凋亡时c A M P 的作用，发现上调c A M P 的试剂，包括D B —c A M P 、C P T —c A M P 、8 - B r —c A M P 和f o r s k o l i n 能显著抑制熊果酸诱导的细胞凋亡，依赖c A M P 的P K A 抑制剂包括H 8 9 和K T 5 7 2 0 则完全抑制熊果酸诱导的H L 一6 0 细胞凋亡，而分化诱导剂如D M S O 和维甲酸( R A ) 却没有影响。
这些结果说明c A M P ／P K A 信号传导通路可能影响熊果酸诱导肿。