《IGF1对体外培养的HKC细胞表型变化的作用及FK506对HKC转分化的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《IGF1对体外培养的HKC细胞表型变化的作用及FK506对HKC转分化的抑制作用（63页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国協和医科大学硕士学位论文IGF-1对体外培养的HKC细胞表型变化的作用及FK506对HKC转分 化的抑制作用姓名：杨继红申请学位级别：硕士专业：内科学肾脏病指导教师：郑法雷;吴华2003.5.1中国协和医科大学硕士研究生论文I G F 1T G r - DS M AD M E MA E CE M TF I T CH K CM y o FT E M TL A BM E TP B SN F K BN B T ，B C l P英文缩略词i n s u l i n f i k eg r o w t hf a c t o r - It r a n s f o r m i n gg r o w t h
2、f a c t o r - 3a - s m o o t hm u s c l ea c t i nD u l b e c c o sm o d i f i e dE a g l e sm e d i u m3 - a m i n o 一9 - e t h y i c a r b o z o l ee p i t h e l i a lm e s e n c h y m a lt r a n s f o r m a t i o nf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t eh u m a nk i d n e yc e l lm y o f
3、i b r o b l a s tt u b u l a re p i t h e l i a l - - m y o f i b r o b l a s tt r a n s -d i f 代n t i a t i o nl a b e l e ds t r e p t a v i d i n b i o t i nm e t h o dm e s e n c h y m a le p i t h e l i a lt r a n s f o r m a t i o np h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n en u c l e a rf a c
4、t o r - K Bn i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 - i n d o x y lp h o s p h a t ef i b r o n e c t i n胰岛素样生长因子1转化生长因子B静平滑肌肌动蛋白D u l b e c e o 改良培养基3 氨基9 乙基咔唑上皮间充质转分化异硫氰酸荧光素人肾小管上皮细胞肌成纤维细胞小管上皮肌成纤维细胞转分化链卵自素生物素标记法问充质上皮转分化磷酸缓冲液核因子，1 c I 氯化硝基四氨唑蓝，5 溴- 4 氯3
5、 一吲哚磷酸纤粘连蛋白2中国协和医科大学硕士研究生论文摘要背景肾小管间质纤维化是各种肾病的终末期共同表现，其主要的病理变化是肾小管上皮细胞的减少，细胞外基质积聚以及一定阶段内间质中出现较多的肌成纤维细胞( M y o f i b r o b l a s t ，M y o F ) 。近来的研究认为间质中M y o F 除来源于成纤维细胞的活化外，部分来源于小管上皮细胞的转分化。小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞( T E M T ) 可能是进展住肾脏疾病发生间质纤维化的重要机制之一。已有的研究发现T G F B 和b F G F 能单独诱导小管细胞的转分化，但其它细胞因子的作用尚不清楚，且T G
6、F B 是T E M T 最强有力的诱导剂，关于I G F 1 在肾小管上皮细胞转分化作用的研究尚未见报告。探讨I G F l 在T E M T 的作用，对认识肾间质纤维化的机制很有帮助。新型的免疫抑制剂他克莫斯( F K 5 0 6 ) 已成功地应用于各种器官移植，探讨其对细胞因子诱导的小管上皮细胞转分化的影响，可以为移植后抗排斥反应，及治疗其它免疫性疾病提供新的理论依据；反之，对F K 5 0 6 引起的肾毒性是否涉及小管上皮细胞转分化，其安全性是否优于其它免疫抑制剂是非常有益的探讨。研究目的( 1 ) 在体外培养的条件下，探讨I G F 一1 能否诱导H K C 细胞发生表型变化，以及I
7、 G F l 和T G F B 是否具有协同作用；( 2 ) F K 5 0 6 对细胞因子诱导的小管上皮细胞表型变化的影响，并进一步了解F K 5 0 6 对T E M T 的影响与N F K B的活性的关系。方法及内容本实验选择H K C 细胞为研究对象，第一部分，分为4 组：( 1 )阴性对照组：( 2 ) T G F S ( 8 n g m 1 ) 阳性对照组：( 3 ) I G F 1 各浓度组( 1 ，1 0 ，5 0 ，2 5 0 n g m 1 ) ：( 4 ) T G F - B + I G F l 联合用药组：I G F - l ( 5 0 n g m 1 ) + T G
8、F B( 8 n g m 1 ) 、I G F - 1 ( 2 5 0 n g m 1 ) + T G F p ( 8 n g m 1 ) 。应用形态学、间接免疫荧光法，免疫组化双染技术、流式细胞技术和酶联免疫吸附法观察I G F l 、T G F B 、I G F - 1 与T G F p 联合作用组诱导H K C 细胞发生表型变化和细胞外基质的形成。第二部分。在H K C 细胞培养液中加入F K 5 0 6 ，分为以下4 组：( 1 ) 阴性对照组；( 2 ) T G F B ( 8 n g m 1 ) 阳性对照组；( 3 ) F K 5 0 6 ( 0 1 、1 、1 0 、5 0 n
9、g m 1 ) 组：( 4 ) T G F B ( 8 n g m 1 ) + F K 5 0 6 ( O 1 、1 、1 0 、5 0 n g m 1 ) 组；应用以上方法，中国协和医科大学硕士研究生论文观察F K 5 0 6 对T G F 母诱导的H K C 细胞转分化的抑制作用；同时应用间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜和免疫组化技术，观察T G F B 和F K 5 0 6 对H K C 细胞N F K B 活性的影响。结果( 1 ) I G F 一1 ( 5 0 ，2 5 0 n g m 1 ) 诱导H K C 细胞失去表达钙粘蛋白和角蛋白，开始表达a S M A 和波形蛋白，使细胞培养
10、上清液的纤粘连蛋白和I 型胶原浓度明显增高；( 2 ) I G F 一1 ( 5 0 ，2 5 0 n g m 1 ) 与T G F 一8 ( S n g m 1 ) 联合作用组使H K C 细胞a S M A 的表达，细胞培养上清液纤粘连蛋白及I 型胶原的浓度均明显高于各单独作用组( P 0 0 5 ) ；I G F l ( 5 0 n g m 1 )和T G F B ( 8 n g m 1 ) 从2 4 小时起明显增加纤粘连蛋白和I 型胶原的浓度，7 2 小时内继续升高，P 0 0 5 ) T h eH K Cc u l t u r e dw i t hT G F p ( S n g m
11、1 ) b e c a m ee l o n g a t e da n df i b r o b l a s t l i k e ，t h o s et r e a t e dw i t hF K 5 0 6a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ( O 1 ，1 ，10 ，5 0n g m 1 ) r e m a i n e dc o b b l e s t o n e l i k ef o r m W h i l et h ec h a n g eo fH K Ct r e a t e dw i t hT G F p ( 8n g m
12、 1 ) p l u sF K 5 0 6a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ( 0 1 ，1 ，1 0 ，5 0n g m 1 ) w a sn o tS Oo b v i o u s l ye l o n g a t e dc o m p a r e dw i t ht h eH K Cc e l lt r e a t e dw i t hT G F 一6a l o n e T h ee x p r e s s i o no fc y t o k e r a t i nw e r em a r k e d l yd e c r e
13、 a s e di nH K Ct r e a t e dw i t hT G F B T h ee x p r e s s i o no fc y t o k e r a t i ni nH K Ct r e a t e dw i t hF K 5 0 6a l o n ew e r et h es a m ea st h ec o n t r o l ，t h ee x p r e s s i o no fc y t o k e r a t i nw e r es o m e w h a ti n c r e a s e di nH K Ct r e a t e dw i t hT G F
14、 pp l u sF K 5 0 6a t0 1 ，1 ，10 ，5 0n g m l6中国协和医科大学硕士研究生论文c o m p a r e d 诵t 1 1t h o s et r e a t e d 惭t l lT G F Ba l o n e ，T h ee x p r e s s i o no fv i m e n t i ni nH K Cc u l t u r e d 州t hT G F Bw a sm u c hn o t a b l et h a nt h ec o n t r o l ，t h ee x p r e s s i o no f v i m e n t i n
15、i nH K Cc u l t u r e d 晰mT G F 一1 3p l u sF K 5 0 6a t0 1 ，1 ，1 0 ，5 0n g m lw e r eo b v i o u s l yd e c r e a s e dt h a nt h o s ec u l t u r e dw i t hT G F 一1 3a l o n e F K 5 0 6a tc o n c e n t r a t i o n l ，1 0 ，5 0 n g m lm a yr e d u c e一S M Ae x p r e s s i o n so fH K Cc e l l si n d
16、u c e db yT G F Bi nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r ( P 0 0 5 ) ；I G F 一15 0 n g m l 、2 5 0 n g m l 组、T G F B8n g m l 、I G F 一15 0 n g m l + T G F B8n g m l 组、I G F 一12 5 0 n g m l + T G F B8n g m l 组与无血清对照组比较，有显著性差异，( P O 0 5 ) 。见表1 2 ，1 3 ，图1 ，5 。中国协和医科大学硕+ 研究生论义表1 - 2 ：I G F 1 作用时H K C 细胞a - S M A 阳性率的变化( )平行组! 鱼堡：! ! 皇望鱼! 1 011 05 02 5 0与对照组比较，P 00 5 。2 l中国协和医科大学硕士研究生论文+
