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1、 原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，沦文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：兰生年互堕日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息
2、研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名耻导师期：吐年 0 0 5 ) ，余各组间比较差异均具有统计学意义( P 0 0 5 ) ，其中联合用药组高于同等浓度的单独用药组，甚至高于两倍浓度的单独用药组。袁1 3M T T 法检测T A M 和A D M 联合用药不同时间段的细胞抑制率( 工5 ，n = 3 )注：与T A M ( 5 ) 组比，+ P 0 0 5 ；与A D M ( 5 ) 组比，4 P 0 0 5 ；与A D M ( 5 ) & T A M ( 5 ) I ：E ，。P 0 0 5 。1 6硕士学位论文讨论4 讨论骨肉瘤是临床
3、上常见的恶性骨肿瘤，其发病率在原发性恶性骨肿瘤中最高，近2 0 年来有多发趋势。在临床治疗方案中，自1 9 8 2 年R o s e n 提出“新辅助化疗”概念以来，骨肉瘤患者5 年生存率获得了显著提高，从而使得保肢手术成为了治疗骨肉瘤患者的首选方法。在我国，近十年来，骨肉瘤患者的5 年生存率达到7 5 7 7 6 ，平均6 4 0 ；5 年无瘤生存率为3 4 8 6 9 7 ，平均5 6 0 I ”J 。虽然手术和大剂量联合化疗的应用使患者的预后得到了明显的改善，但由于骨肉瘤恶性程度高，转移早，部分患者就诊时就已发现肺部的转移，再加之骨肉瘤的对传统化疗药物耐药等各种原因使得骨肉瘤患者的5 年
4、无瘤生存率已经进入了一个平台期 3 】。高剂量的化疗药物带来的毒副作用如肾毒性、骨髓抑制、心脏毒性以及肿瘤药物对传统化疗药物的多药耐药性的产生，正在成为目前骨肉瘤临床治疗的难题。而且想要通过基因方法来识别骨肉瘤高危患者并且应用于治疗中还具有一定困难，这是因为不但骨肉瘤多数为散发病例，且不同于尤文氏肉瘤在基因排列方面具有明显特征，具有基因改变的家族型骨肉瘤也很罕见。因此，通过有效的化疗增加骨肉瘤患者预后变得越来越重要，如何提高骨肉瘤对传统化疗药物的敏感性来达到提高临床治疗疗效已经成为目前骨肉瘤治疗领域待解决的重大问题。内分泌治疗主要是通过抑制相应的性激素合成、阻断性激素与性激素受体的结合、或在性
5、激素受体的活性方面干预、甚至降低性激素水平等方式，从而达到抑制性激素依赖性肿瘤的生长，甚至可与传统化疗药物疗效一样使肿瘤缩小。但相对于后者，它具有副作用小、低毒、效应持久、作用于全身的独特优点，最重要的是，它对于已发生肿瘤远处转移的晚期患者同样有较好的疗效，其最早应用于乳腺癌。近年来，研究发现在某些非生殖系统肿瘤同样有E R 的表达【16 | ，如G r e n m a n 等报道在头颈部鳞状细胞癌，以及舌鳞状细胞癌中，均检测到E R 的表达f l7 1 。同样在涎腺导管癌q b W i l l i a m s 等检测到高表达的E R 3 ，并进一步发现肿瘤的复发与E R B 的缺失密切相关【
6、l 踟。部分肿瘤经抗雌激素受体治疗后肿瘤缩小，患者生存期延长I l 圳。由于观察到骨质疏松症、骨性关节炎等骨骼非恶性疾病往往好发于女性，临床研究也表明雌、孕激素联合治疗能有效防治骨质疏松症t 2 m2 1 1 ，这些都说明雌硕士学位论文讨论激素对成骨细胞活性具重要影响。骨肉瘤的好发年龄段为1 0 2 0 岁，男性多于女性而性激素水平最活跃的时期恰好为该段时问。这提示我们体内雌孕激素水平及相应受体表达异常是否与骨肉瘤发病相关及预后，目前相关研究尚无定论，数量较少，而该研究具有一定意义，值得进一步探讨。实际上，研究表明E R 与部分恶性肿瘤的发生发展密切相关，包括E R 口F t 性的性激素靶腺器
7、官和E R 阳性的非性激素靶腺器官。在E R 阳性的乳腺癌中，乳腺癌组织内细胞的数目可通过高水平的雌激素与E R 相结合而明显增加。在前列腺癌中，E R 3 缺失可能是作为前列腺上皮细胞在机体F 常增殖调控的逃逸机制之一，这是因为，在癌组织中检测发现有E R 3 的高表达，且前列腺上皮细胞明显增生的现象也在E R B 基因剔除的裸鼠身上发现1 2 2 J 。L e a r 等关于前列腺上皮细胞异型增生的早期阶段的研究发现，高度恶性的前列腺上皮内瘤E R B 相对于低度恶性的前列腺上皮内瘤E R p 表达减少【2 3 1 。因此，E R l 3 的作用可能是在高分化的前列腺异型增生细胞中减缓异型
8、细胞增生的速度：而在高度恶性的前列腺异型增生细胞非典型增殖阶段未见E R 6 ，这种表达缺失使肿瘤细胞的侵袭性增强口4 1 。在肝癌中，E R以及E R 的变异体同样可以检测到，而后者与肝癌的高氧化应激、临床侵袭性有关。而且E R G t 和E R l 3 的表达水平在不同诱因所导致的肝癌中，明显不一样，从而提示肝癌的形成和发病机制的不同与之相关。在骨肉瘤方面，目前关于骨肉瘤组织及细胞株中性激素受体表达的文章较少，但结论普遍认为存在性激素受体表达。自1 9 8 0 年s t e d m a I l 【2 5 】首次用凝胶过滤法在骨肉瘤组织中检测到E R ，w a l k e r 2 6 1 等
9、通过免疫组化法对4 例骨肉瘤组织研究，结果发现有2 例E R 阳性，表明骨肿瘤的生长直接受作用于性激素的相应受体对起直接作用，从而掀开人们对骨肉瘤与性激素之间关系关注的序幕。其后在细胞培养技术和动物实验方法方面，又有学者对骨肉瘤细胞中性激素受体的表达进行检测，如A n uK a l l i o a 2 7 1 等通过骨肉瘤U 2 0 S 细胞株进行体外实验，发现雌二醇主要通过E R a 和E R p 介导而产生抗成骨细胞凋亡效应。R a j a b a l i a n S 2 8 等在原代培养建立的尤文氏肉瘤细胞株S S E S 1 表达E R a ，且故细胞株的生长可被T A M 所抑制。O
10、 s a m u D o h i 掣8 J 对2 8 f f | J 骨肉瘤组织中进行试验研究检测出2 3 例E R I C H 性，2 4 例P R阳性，无一例为E R a 阳性。S a r a i v a 等【2 9 j 在E R 受体阳性的骨肉瘤细胞株M G 一6 3 和S a O s 2 9 其碱性磷酸酶在雌二醇刺激作用下表达明显上升，提示肿瘤生长较快可以硕士学位论文讨论藉由此为一依据，F a n g P i n gC h e n 等 3 0 】发现E R o 和E R p m R N A 在骨肉瘤M G 6 3 细胞株中均有表达，在培养时间长，分化程度高的细胞6 7 E R l 3
11、m R N A 表达量更高，提示在骨肉瘤细胞分化过程中不同亚型的E R 可能起不同的作用。L i a n g 等【3 l 】报道了M G 6 3 细胞的增殖可以通过孕激素促进，提出在骨肉瘤发病机制和发展过程中孕激素也承担重要的角色。在国内，雷鸣等I 嘲在1 6 例骨肉瘤标本中均发现有E R Q 和E R J 3 的表达，陈展鹏等 3 2 J 用免疫组化法检测T 3 8 例骨肉瘤组织切片中，发现总雌孕激素受体表达阳性率为4 2 1 ，认为雌孕激素受体表达存在于骨肉瘤组织。且E R a 、P R 表达阳性的骨肉瘤患者，预后较检测为阴性的表达者好，其中E 她的表达与p 5 3 存在一定负相关性。刘金
12、钊等【3 3 】研究结果为E R 表达在6 5 侈1 骨肉瘤患者手术标本中的阳性率为4 0 0 ，性别、年龄及发病部位与E R 的阳性表达无明显相关性。杨开初、廖二元等【2 | J 将人骨肉瘤细胞株M G 6 3 作为成骨细胞模型研究，发现M G 6 3 细胞株存在E R u 和E R 3 基因的m R N A 表达。本研究采用R T - P C R 检测人骨肉瘤细胞M G 一6 3 E R a 和E R l 3 的表达，结果均为阳性，这一结果与文献报道一致。但在文献报道在同一骨肉瘤细胞系中E R n 和E R B 的表达程度不一致，这意味着在骨肉瘤中它们各自具有不同的作用。而病例组织分型、选
13、取标准、检测抗体及检测方法不同可能使导致文献报道中E R 在骨肉瘤组织中表达的差异的原因，尚需扩大样本量研究。在恶性肿瘤的内分泌治疗中，T A M 属于一种非甾体类的选择性雌激素受体调节剂，其作用为部分激动E R 一0 【，完全拮抗E R 一1 3 。由于其副作用小，治疗剂量下仅偶见有胃肠道副反应，个别病例可有白细胞和血小板减少【3 4 】，近三十多年来，在乳腺癌的内分泌治疗中取得了良好的疗效【3 5 。在治疗E R 阳性的乳腺癌中，它主要通过竞争性抑制雌激素与细胞内E R 的结合，阻断雌激素信号传导通路，从而干扰R N A 转录，抑制肿瘤细胞增殖 3 6 】。同时文献报道在E R 阴性的恶性
14、肿瘤如恶性黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌中，它通过影响例如抑制蛋白激酶C ( P K C )和钙调蛋白依赖环磷酸腺苷磷酸二酯酶( C a l m o d u l i n d e p e n d e n tc A M PP h o s p h o d i e s t e r a s e ，C D P ) 的活力、诱导T G F p l 的分泌细胞信号传导通路中的因子，而发挥它的抑瘤作用【37 1 。此外，端粒酶的活性可以被T A M 所抑制，达到诱导细胞周期停止，导致细胞凋亡的目的1 3 引。鉴于S E R M s 在乳腺癌以及其他E R I C H 性的非性激素靶器官肿瘤和E R 阴性的恶性肿瘤中
15、的抗肿瘤作用，我们探索是否在硕士学位论文讨论S E R M s 在E R I g 日性的人骨肉瘤细胞株M G - 6 3 中具有相似的作用。此次实验结果表明，T A M 对入骨肉瘤细胞株M G 6 3 的增殖有明显的抑制作用，且在一定浓度和时间范围内该抑制作用具有时间和剂量依赖性。在细胞形态学变化观察方而，对照组的细胞在普通倒置显微镜下观察可见细胞呈贴壁生长，细胞形态大多为细梭形或多角形，体积较大，大小均匀，折光性良好，可见圆形细胞核，胞浆透亮，细胞膜清晰光滑，细胞增殖状态良好。在浓度为5 t x m o I L 的T A M 作用下，随着时间的延长，可见细胞形态变化明显，由最初的梭形变为圆形
16、，细胞间距离变大，变圆的细胞数量逐渐增多，存活细胞颜色晦暗，胞浆内颗粒增多增粗，细胞出现皱缩的现象，最后破碎，漂浮在液面上。通过对本实验中M T T 法测得的T A M 在1 9 m o l L 、2 t m o l L 、5 p m o l L 、1 0 p m o l L 的2 4 h 抑制率分别为2 4 9 、8 8 0 、2 0 8 5 及3 1 5 2 。5 9 m o l L 的T A M 作用下，细胞2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 生存率分别为2 0 8 5 、3 9 5 7 及6 2 5 1 。实验结果进行统计学分析显示：T A M 具有较好的抑制人骨肉瘤细胞M G 6 3 的作用，且该生长抑制作用在一定浓度和时间范围内呈现显著的剂量一效应和时间效应。A D M 作为骨肉瘤化疗的经典一线药物之一，其作用机制一直在探索过程中，目前有关A D M 的作用机制主要包括【3 9
