《他汀类药物对血管平滑肌细胞和泡沫巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《他汀类药物对血管平滑肌细胞和泡沫巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶的影响（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学博士学位论文他汀类药物对血管平滑肌细胞和泡沫巨噬细胞分泌基质金属蛋 白酶的影响姓名：栾朝霞申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：裴著果2003.3.1摘要目的基质金属蛋白酶( M M P s ) 在动脉粥样硬化，冠状动脉成形术后和冠状动脉搭桥术后再狭窄以及动脉粥样硬化斑块破裂过程中起着十分重要的作用。因此，抑制M M P s 的生成及其酶活性在抗动脉粥样硬化和增加斑块稳定性的治疗过程中有着十分重要的意义。已往人们曾采用多种方法抑制M M P s ，但均未获得好效果。他汀类药物自七十年代问世以来一直是世界上应用最广泛的降血脂药物，临床试验提示他汀类药物有着降低血脂以外的改
2、善斑块生物学特性的作用。最近的研究发现他汀类药物抑制人内皮细胞 分泌M M P 一1 ，明显抑制鼠巨噬细胞中M M P 一9 的分泌和活性。如果他汀 类药物能抑制斑块部位其它种类的细胞分泌多种M M P s ，那么该类药物在稳定斑块的过程中发挥更重要的作用。因此我们研究他汀类药物是否影响 兔和人的血管平滑肌细胞、兔的泡沫细胞分泌M M P 一1 ，一2 ，一3 和一9 ，进而更全面深入地揭示他汀类药物抗动脉粥样硬化发生发展和增加斑块稳定性的机制，为临床治疗提供依据。方法1 细胞培养：将兔主动脉或人大隐静脉段切成碎片，用含1 5 胎牛血清的D M E M 培养基培养。当平滑肌细胞长满培养瓶底面时
3、，用胰蛋白酶悬浮细胞进行传代培养。将1 3 代的传代细胞以2 1 0 5 孔的密度置于6 一孔的培养盘中，准备做w e s t e I T lb l o t 或z y m o g r a p h y 实验，或以1X1 0 6 培养瓶 的密度置于7 5 c m 2 的培养瓶中，准备做R T P C R 或E M S A 实验。对所有的试验，当细胞长至8 0 满时，换用无血清培养基培养3 天，更换无血清培养基，并加入适当浓度的待观察物质，孵育适当时间。兔泡沫细胞来源于高胆固醇饮食饲养的新西兰白兔的皮下颗粒瘤，如参考文献所述。将细胞以5X1 0 5 细胞孔的密度置于2 4 一孔培养盘中，4 5分钟后
4、弃去未粘附于盘底面的细胞，向培养盘中加入新鲜的不含血清的但含有适当浓度待观察物质的巨噬细胞培养基培养4 8 小时。2 w e s t e r nb l o t 分析：经8 聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，封闭，加I 抗，辣根过氧化物酶标记I I 抗，化学发光试剂增强反应，X 线片压片曝光，经光密度仪扫描分析，计算M M P 一1 和M M P 一3 蛋白表达相对量。3 z y m o g r a p h y 分析：经含有2 m g m lg e l a t i n 的7 5 聚丙烯酰胺变性凝 胶分离蛋白，将凝胶置于反应液中3 7 过夜，用0 2 C o o m a
5、 s s i eB r i l l i a n tB l u e 染色2 3 小时，脱色，用G S6 9 0I m a g eA n a l y s i ss o f t w a r es y s t e m 进行 M M P 一2 和M M P 一9 定量分析。4 C o l l a g e n o l y t i c ，p c a s e i n o l y t i e 和g e l a t i n o l y t i c 活性分析：按照使用说明，分别使用T y p eIC o l l a g e n a s eA s s a yK i t ，S t r o m e l y s i na
6、c t i v i t yA s s a yK i t ，T y p eIC o l l a g e n a s eA s s a yK i t 进行相应的酶活性分析。 5 电泳迁移率变动分析( E M S A ) ：将 1 3 2 P A T P 标记至A P l 或N F K B 寡聚核甘酸5 端。提取兔血管平滑肌细胞核蛋白并定量。标记的寡聚核甘酸与核蛋白进行结合反应，6 聚丙烯酰胺变性凝胶分离反应液，将凝胶取出干燥，X 线片压片曝线，放射自显影，光密度仪扫描分析。 6 R T P C R 反应：从2 1 0 6 兔血管平滑肌细胞中提取总R N A ，逆转录，P C R 过程如下：9 4
7、，1 分钟；5 5 ，1 分钟；7 2 ，1 分钟。M M P 一1 ，一 3 ，一9 和T I M P 一1 循环3 3 次，G A P D H 循环2 2 次，T I M P 一2 循环2 5 次。7 统计学方法：所有实验最少重复3 次，统计学处理采用m i c r o s o f te x c e l 软件进行t 检验，P 0 0 5 ，n = 5 ) E f f e c t so fm e v a l o n a t ea n di s o p r e n o i d so na c t i o no fl o v a s t a t i ni nr a b b i tV S M C
8、sa n df o a mc e l l sI n c u b a t i o no fc e l l sw i t hH M G C o Ar e d u c t a s ei n h i b i t o r sc a u s e sm e v a l o n a t es t a r v a t i o n M e v a l o n a t em e t a b o l i s my i e l d sas e r i e so fi s o p r e n o i d s ，i n c l u d i n gt h ec h o l e s t e r o lp r e c u r s
9、 o r ，s q u a l e n e ，a n dg e r a n y l g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e ( G G P P ) ，a ni m p o r t a n tl i p i da t t a c h m e n tf o rt h ep o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o no fR h op r o -t e i n T ot e s tb yw h i c hp a t h w a yl o v a s t a t i ni n h i b i t
10、sM M P s ，w ea t t e m p t e dt or e s c u e M M Ps e c r e t i o nf r o mr a b b i tV S M C sw i t hm e v a l o n a t e ，s q u a l e n eo rG G P Pi nt h ep r e s e n c eo fl o v a s t a t i n A d d i t i o no fs q u a l e n ed i dn o tr e d u c et h ei n h i b i t o r ye f f e c to fl o v a s t a t
11、 i no nM M P l ，一2 ，一3a n d 一9s e c r e t i o n I nc o n t r a s t ，t h ea d d i t i o n9 o fm e v a l o n a t eo rG G P Pc o m p l e t e l yr e v e r s e dt h ee f f e c t so fl o v a s t a t i no nM M P la n d 一3 ，a n dp a r t i a l l yr e v e r s e dt h ee f f e c to nM M P 、一2 ，a n d 一9s e c r e
12、 t i o n S i m i l a r l yt oS M C s ，w ei n c u b a t e dr a b b i tf o a mc e l l sw i t hm e v a l o n a t e ，s q u a 1 e n eo rG G P Pi nt h ep r e s e n c eo fl o v a s t a t i n T h ea d d i t i o no fs q u a l e n es l i g h f l yr e v e r s e dt h ee f f e c to fl o v a s t a t i no nM M P l
13、s e c r e t i o n b u th a dn oe f f e c t so nM M P一3o r9 n ea d d i t i o no fm e v a l o n a t e ( 1 0 0 斗M ) c o m p l e t e l yr e v e r s e dl o v a s t a t i ne f f e c t so nM M P 一3a n dM M P 一9a n dr e v e r s e dt h ee f f e c to nM M P lb v9 2 2 ( P 0 0 5 ，n = 5 ) ( T a b l e5 ) o讨论基质金属蛋
14、白酶是一族锌和钙依赖性蛋白酶，目前人们已发现2 8 种基质金属蛋白酶，依其功能将其分为几大类：c o l l a g e n a s e s ，s t r o m 由s i n s ，g e l a t i l l a B e $ ，细胞膜型( M T M M P s ) ，无确切分类型。C o l l a g e n a s e s 包括M M P 一1 ，1 8 -一8 ，一1 3 ，主要分解I ，I I ，I I I 型C o l l a g e n ，其中M M P 一1 为该类型的代表；g e l a t i n a s e s 包括M M P 一2 ，一9 ，主要分解基底膜基质成分
15、和I V 型C o l l a g e n ；s t r o m e l y s i n s 包括M M P 一3 ，一1 0 ，一1 1 ，有着广泛的分解底物，包括p r o t e o g l y c a n s ，l a m i n i n ，f i b r o n e c t i n ，g e l a t i n 和基底膜c o l l a g e n ，其中M M P 一3 为该类型的代表。除了细胞膜型外，其它几种均被分泌到细胞外基质中，一旦被激活，这些基质金属蛋白酶协同作用将彻底分解所有基质成分，在细胞外基质重吸收过程中起着十分重要的作用，2 。当血管壁受损或发炎时，病变部位M M
16、 P s 的表达明显增高，导致局部细胞外基质成分的降解，从而引发一系列病理过程，如动脉粥样硬化、再狭窄和动脉瘤形成等雎，1 4 ，玩2 6 1 。更为重 要的是，M M P s 在动脉粥样硬化斑块破裂的过程中起着十分重要的作用，因为斑块的主要成分为胶原蛋白，易破裂斑块的特征性病理改变为胶原蛋白含量减少和巨噬细胞增多，过多的M M P s 能将胶原蛋白完全分解，使局部变薄弱，对收缩期血流对管壁冲击的抵抗力降低，易导致斑块破裂【6 ”。因此，抑制M M P s 的生成及其酶活性在抗动脉粥样硬化和增加斑块稳定性的治疗过程中有着十分重要的意义。已往人们曾采用外原性T I M P s 、锌离子鳌合剂、合成肽、糖皮质类激素和局部反义寡聚核苷酸等多种方法抑制M M P s ，但均未获得好效果。他汀类药物自七十年代问世以来一直是世界上应用最广泛的降血脂药物，大规模的临床药物试验表明他汀类药物能够明显降低急性冠状动脉事件的发生率和冠心病的死亡率9 驯。临床试验表
