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1、分类号：R 3 4密级：公开单位代码：1 0 4 2 2学号：2 0 0 9 2 0 4 2 60 东岁，孳 S H A N D o N GU N I V E R S I T Y 博士学位论文D i s s e r t a t i o nf o rD o c t o r a lD e g r e e论文题目：m i c r o R N A 2 1 通过靶向P I A S 3 和S T A T 3信号途径负性调节R A N T E S 和I P 一1 0 释放及肿瘤淋巴细胞浸润m i c r o R N A - - 2 1n e g a t i v e l yr e g u l a t e sR
2、 A N T E Sa n dI P - 1 0r e l e a s ei nM C F - 7b yt a r g e t i n gP I A S 3a n dS T A T 3s i g n a l i n ga n da f f e c t sl y m p h o c y t e si n f i l t r a t i o n作者姓名王志宇合作导师2 0 1 3 年1 0 月7 日原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的
3、个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：王茎：昱日期：塑! ! ：! 三：l关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后廊遵守此规定)论文作者签名：三趾导师签名山东大学博士学位论文论文目录中文摘要I英文摘要6符号说明1 2论文正文材料方法2 2结果4 2附图5 8参考文献8 7绢；述1 0 2山
4、东大学博士学位论文致谢1 1 1攻读博士学位期间发表的学术论文目录1 1 2英文文章l 1 1 3英文文章2 1 3 2山东大学博士学位论文C A T A L O G U EC h i n e s eA b s t r a c t 1E n g l i s hA b s t r a c t ，6A b b r e v i a t i o n 1 ：!T e x tI n t r o d u c t i o n 1 4M a t e r i a la n dM e t h o d s 。2 2R e s u l t s z I ：!D i s c u s s i o n 4 8C o n c l
5、 u s i o n ，5 7F i g u r e s 5 8R e f e r e n c e s 8 7R e v i e w 1 ( ) ：!山东大学博士学位论文A c k n o w l e d g e m e n t 111P u b l i s h e dr e s e a r c hp a p e r s 11 2P a p e r1 11 3P a p e r2 1 3 2山东大学博士学位论文m i c r o R N A 2 1 通过靶向P I A S 3 和S T A T 3 信号途径负性调节R A N T E S 和I P 一1 0 释放及肿瘤淋巴细胞浸润博士生王志宇导
6、师韩金祥教授专业生物化学与分子生物学中文摘要肿瘤淋巴细胞浸润( T u m o ri n f i l v r a t i n gl y m p h o c y t e s ，T I L ) 是预测免疫治疗疗效、判断预后的重要病理指征。研究表明，炎性组织内C D 8 + T 淋巴细胞浸润与粘附分子和趋化因子作用有关。多条胞内途径调节趋化因子表达，包括S T A T 3 信号途径、N o t c h 途径、B c a t e n i n 途径和P 1 3 K 途径等。粘附分子、趋化因子和细胞因子等炎性介质，及其相应的分子信号途径共同组成肿瘤微环境中复杂的免疫调控网络。其中，关键趋化因子异常，可能抑
7、制免疫活性细胞进入肿瘤组织，从而成为影响免疫治疗效果或产生免疫抵抗( i m l u n o r e s i s t a n c e ) 的重要因素。因此，深入探讨淋巴细胞肿瘤浸润的分子机制，对于发现新的治疗策略及提高免疫治疗效果具有重要意义。M i c r o R N A s ( m i R N A s ) 是一类长度约1 8 - 2 4 个核苷酸的内源性非编码R N A ，通过与靶基因m R N A3 端U T R 区同源结合，抑制m R N A 翻译或导致m R N A 降解。m i R N A s 调节多种重要的细胞功能，如细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生。m i R N A s同时参与
8、肿瘤炎症反应，对免疫细胞移动、免疫原性( i m m u n o g e n i c i t y ) 等具有重要调控作用。m i R N A 一2 1 是一种原癌m i R N A ，在大多数肿瘤中均有表达。m i R N A 一2 1 通过抑制多种靶基因，调控细胞增殖、移动和侵袭、凋亡及药物抵抗。生物信息学研究表明S T A T 3 可能是m i R N A2 1 的靶基因。另有研究证实，在骨髓瘤细胞中P I A S 3 ，即活化S T A T 3 抑制物( p r o t e i ni n h i b i t o ro fa c t i v a t e dS T A T 3 ，P I A
9、S 3 ) ，是m i R N A 一2 i 的靶基因。既往研究表明，S T A T 3 在多种类型恶性肿瘤中组成性活化，能够调控多种肿瘤炎症相关重要靶基因表达，如I L 一6 、山东人学博士学位论文I L 一1 0 、C O X 2 。阻断肿瘤细胞内S T A T 3 表达，可调控趋化物质表达，诱发包括淋巴细胞在内的多种类型免疫细胞移动。基于上述研究，我们提出如下假晚：m i R N A 一2 1 可能调节肿瘤细胞分泌趋化冈子并诱导淋巴细胞移动；其作用靶点可能是S T A T 3 密切相关基因，如S T A T 3或P I A S 3 ；上述m i R N A 一2 卜S T A T 3 一
10、趋化因子信号途径可能是调节肿瘤淋巴细胞浸润的重要分子机制。本研究以乳腺癌为研究对象。主要从以下方面进行：研究目的1 筛选与乳腺癌淋巴细胞浸润有关的m i R N A s ，即在肿瘤组织中有淋巴细胞浸润的乳腺癌患者的外周血中哪些m iR N A s 的表达被上调或下调。2 研究被上调或下调的m i R N A 对乳腺癌细胞系M C F 一7 的调控作用，即是否与预期相符调节了趋化因子的分泌。3 探讨上调或下调的m i R N A 发挥上述调节作用的机制。研究方法1 肿瘤组织内有或无淋巴细胞浸润的乳腺癌患者，血清中m i R N A s 表达的差异1 1 组织切片H E 染色，显微镜下观察肿瘤组织
11、中淋巴细胞浸润情况。1 2 荧光定量R T P C R 方法检测对应外周血血清中m i R N A 一1 5 5 和m i R N A2 1的表达水平。1 3 统计分析血清中m i R N A s 表达与肿瘤组织内淋巴细胞浸润的相瓦关系。2 表达变化的m i R N A 对M C F 一7 细胞分泌趋化因子及淋巴细胞移动的影响2 1 将合成的m i R N A 一2 1 模拟物和m i R N A 一2 1 抑制物分别转染I C F - 7 细胞，7 2 h 后E L I S A 检测细胞培养上清中趋化因子R A N T E S 和I P - 1 0 的表达。2 2 以上述m i R N A 一2 1 抑制物转染M C F 一7 细胞，取细胞培养上清作为条件培养基，T r a n s w e l l 体外趋化实验分析在M C F 一7 细胞内下调m i R N A 一2 1 对小鼠脾脏分离淋巴细胞的趋化作用。3 表达变化的m i R N A 调节M C F 一7 细胞分泌趋化因子的作用机制研究山东大学博士学位论文3 。1W e s t e r nb l o t 和荧光定量R T - P C R 检测预测靶基因的表达水平，验证确定靶基因( 根据文献
