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1、第四军医大学博士学位论文兔组织工程膀胱实验研究姓名：严泉剑申请学位级别：博士专业：外科学（泌尿外）指导教师：邵国兴2003.5.1秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是藐个人导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与莪一同工作的同志本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：至垒望日期本A 完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读位
2、期间论文I 作的知识产权单位居第四军医大学。本A 保证毕业离校后，发论文或使用论文I 作成果时署名单位仍然为第匹军医大学。学校有权保留送论文的复印件，允许论文被杳阿和借闲；学校可以公布论文的全部或部分内( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他复嗣手段保存论文。论文作者签名：雄导师签名仰围易日期：! ：秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是藐个人导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与莪一同工作的同志本研究所做的任何贡献均已在论文
3、中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：至垒望日期本A 完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读位期间论文I 作的知识产权单位居第四军医大学。本A 保证毕业离校后，发论文或使用论文I 作成果时署名单位仍然为第匹军医大学。学校有权保留送论文的复印件，允许论文被杳阿和借闲；学校可以公布论文的全部或部分内( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他复嗣手段保存论文。论文作者签名：雄导师签名仰围易日期：! ：英文缩写英文全称A S C S B A M GB D R B S A D A B D M E M D M S OE
4、 D l I AE SF B SF GH EH G F sH IH R PK G ML P PM S C sN T N Z W RP B SP m a xP V AP V PR P M I l 6 4 0S P FV o l m a x W M C s缩略语表A d i p o s es t r o m a Ic e l l sB l a d d e ra c c e l l u l a rm a t r i xg r a f tB l a s t o c y s td e v e l o p m e n tr a t eB o v n es e r u ma l b u m i nD i a
5、 m e n o b e z i d i nD u l b e c c oe a g l e Sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u mD i m e t h y ls u l f o x i d eE t h y l e n e d i a m i n o t e t r a a c e t i ca c i dE m b r y os t e me e l IF e t a lb o v i n es e r u mF i b r i ng l u eH e m a t o x y l i na n de o s i nH e p a t o c
6、y t eg r o w t hf a c t o r sH y p e r t r o p h i cI d e xH o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eK e r a t i n o c y t eg r o w t hm e d i u mL e a k - p o i n tp r e s s u r eM a r r o ws t r o m a lc e l l sN u c l e a rt r a n s f e rN e WZ e a l a n dw h i t er a b b i t sP h o s p h a t eb u
7、伟玎s o l u t i o n M a x i m u mp r e s s u r ea tm i c t u r i t i o nP o l y v i n y la l c o h o lP o l y v i n y lp y r r o l i d o n eR o s e w e l lp a r km e m o r i a li n s t i t u t e 1 6 4 0m 酣i u mS p e c i f i cp a t h o g e nf r e eM a x i m u mv o l u m eW h o l em a r r o wc e l l s中文
8、名称脂肪基质细胞 膀胱无细胞基质囊胚形成率牛血清白蛋白 二氨基联苯氨 D M E M 培养基二二甲基距砜乙二二胺四乙酸胚胎干细胞胎牛衄清纤维蛋白胶苏小索伊红染色且十细胞生K 闪子肥人指数辣根过氧化物酶角朊细胞培养基渗i | l I j 压骨髓基质细胞核移植新两兰白兔磷酸盐缓冲液膀胱最人压力聚乙烯醇聚乙烯吡咯烷酮 R P M I1 6 4 0 培养基 无特定病原体展人容积全骨髓细胞兔组织工程膀胱实验研究研究生严泉剑 导师邵国兴教授 单位西京医院泌尿外科摘要峙胱组织工程替代是目前比较新的的治疗膀胱缺损或功能衰竭的方法，包括利用种植或未种植自体细胞的支架材料治疗的多种替代方法。本试验尝试应用膀胱无细
9、胞基质( B A M G ) 复合自体细胞或肝细胞生长因子( H G F s ) 构建组织工程膀胱在兔膀胱部分切除术后进行膀胱替代的应用，应用核移植技术拓展膀胱种子细胞来源。 J卜目的：观察H G F s 对膀胱平滑肌损伤的影响，探讨B A M G 和H G F s在兔构建组织工程膀胱构建中的应用，尝试应用核移植技术拓展膀胱种子细胞来源。r ( 方法：( 1 ) 制备新西兰兔单纯膀胱前壁肌层组织缺损创面3 个，面积l c m 2 大小，分别涂敷p U D K H ，溶媒以及空载体，观察创面愈合速度，比较肥大指数( H y p e r t r o p h i ci n d e x ，H I )
10、；( 2 ) 简化B A M G 制备步骤，M a s s o n s 染色，醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，光镜及电镜检查制备效果；( 3 ) 用B A M G 复合自体骨髓基质细胞，脂肪基质细胞，膀胱平滑肌细胞和上皮细胞，p U D K H + F B 制备组织工程膀胱，分别用于兔膀胱次全切除替代，观察替代手术后的膀胱测压参数变化，影象学变化，组织形第聃军医人学博t ：学位论文念变化。( 4 ) 分别利用猪骨髓基质和脂肪基质细胞作为核供体，采用卵细胞胞质内直接注射法构建移核胚胎，比较囊胚形成率，观察孵化囊胚细胞染色体变化。结果：( 1 ) 新西兰兔单纯膀胱前壁肌层组织缺损模型上，溶媒对照组A ，空
11、载体对照组B 以及p U D K H 治疗组C 创面面积7 天时分别为4 4 士8m m 2 ，4 3 + 9 m m 2 和2 8 + 6 m m 2 ，1 4 天时分别为2 3 + 7 m m 2 ，2 2 + 6 m m 2 和4 士4 m m 2 。将初始创面面积，7 天和1 4 天时创面面积数据应用重复测量方差分析，3 组间愈合速度差异有统计学意义，F = 1 6 2 3 6 。P = 0 0 0 ；C 组和A ，B 组之间比较，面积减少差异有统计学意义，P = 0 0 0 ：A ，B 两组之间差异无统计学意义，P = 0 6 4 7 。术后3 0 天对横贯正常膀胱，过渡区和愈合创面
12、的膀胱标本进行H E 组织学检查，p U D K H 治疗组与自体膀胱具有相似的正常的组织学结构，溶媒以及空载体对照组粘膜下纤维组织增生加厚而肌层较薄；三组的H 1 分别为1 7 6 + 0 1 7 ，1 8 3 + 0 1 8 和1 1 1 士0 1 8( P = 0 0 0 ，C 坩A a n d B ；P = 0 0 5 4 ，A 似B ) ，提示C 组瘢痕较A ，B 组少。( 2 )预实验所用B A M G 制备方法周期至少为6 0 小时，金宁公司采用我们改进的方法制备B A M G 周期最长是2 6 小时。利用我们改进的方法制备的B A M G 呈半透明状，抗漏尿能力好。改进的方法制
13、备B A M G 周期缩短3 4 小时，M a s s o n s 染色，醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，光镜及电镜检查。粗细不一的胶原纤维在兔B A M G 内松散地堆积在一起，看不到细胞膜，细胞器和染色质的残留。( 3 ) 分离的膀胱上皮细胞在倒置相差显微镜下观察，形状为多角形，鹅卵石状，A E l A E 3 抗体染色膀胱上皮细胞呈阳性；膀胱平滑肌细胞形态为梭形，a 肌动蛋白抗体染色膀胱平滑肌细胞阳性；倒置相差显微镜下兔M S C s 与A S C s 形态相似，呈梭状或纺锤状，易于贴壁，融合A S C s 细胞爬片H E 染色，部分分化细胞显示脂肪空泡不第州军医人学博f 。学位论文染色，胞浆呈
14、红色，胞核呈蓝色，未分化A S C s 细胞看不到脂肪空泡。用B A M G 复合自体膀胱平滑肌细胞和上皮细胞，骨髓基质细胞或脂肪基质细胞，p U D K H + F B 制备组织工程膀胱的时间分别为4 周，3 周，3 0分钟。术后1 2 周进行膀胱测压显示：原位缝合组A 动物能够维持2 3 的自体膀胱原有容量。单用B A M G 组B ，膀胱容量恢复到术前的8 5 。应用B A M G 复合自体膀胱平滑肌细胞和上皮细胞，A S C s ，M S C s 或H G F s构建的组织工程膀胱组C 、D 、E 、F ，容量分别恢复到9 7 ，9 4 ，9 5 和9 2 。5 组膀胱顺应性分别恢复到
15、原来的2 1 ，1 0 8 ，1 0 6 ，1 0 2 ，1 0 7 和1 0 4 。术前术后数据T 检验，差异有统计学意义的是：A 组膀胱容量( J D = 0 0 0 5 3 ) 及顺应性( P = 0 0 1 0 1 ) 均下降；B 组术后L P P 减少( P = 0 0 4 6 ) 及P P 减少( P = 0 0 3 4 ) ；其他组差异无统计学意义。术前术后测量值按重复测量分析，总体分析统显示，手术前后测量值差异有统计学意义：组蒯比较差异无统计学意义。分组分析显示，差异有统计学意义的只有A 组术后膀胱容量减少( J P = O 0 3 5 ) ，顺应性下降( P = O 0 3
16、6 ) 。手术后1 2 周，对A 组的自体膀胱以及从B 、C 、D 、E 和F 组再生膀胱区的标本进行横切片，H E 或三色染色。A 组显示正常的组织学分稚。B组平滑肌纤维已经呈现有机的空间排列，形成了各种各样大小的束状，但再生不完全。C 、D 、E 和F 组，与自体膀胱具有相似的F 常的组织学结构。术后1 2 周，膀胱x 线造影，B 超显示，A 组动物的膀胱而仅仅能够再生很小的储水能力。而组织工程膀胱在体积和轮廓上基本保持正常。( 4 ) 猪M S C s 、A S C s 作为核供体，构建的移核胚胎存活率分别为7 9 0 、7 7 5 ，以移核胚存活率数值为基线值，2 4 小时卵裂率分别为4 5 3 、4 9 2 ，3 6 小时分别为6 5 6 、5 8 2 。囊胚发育率分别为1 6 0 、1 3 4 ，囊胚孵化率为分别为4 3 、3 4 。2 组间率的比较差异无统计学意义第军医入学博1 ：学证论义( P O 0 5 ) 。孵化囊胚细胞的染色
