微生物菌种分离和鉴定技术

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1、微生物菌种分离和鉴定技术微生物菌种分离和鉴定技术微生物纯培养分离技术获得纯培养物对微生物学研究至关重要。纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。液体培养基液体培养基菌悬液连续稀释培养容器中仅含1个菌体单个菌体纯培养物固体培养基固体培养基无菌 土豆片 (1881年)很多细菌不能 在土豆上生长肉膏蛋白胨 培养基 （明胶固化）明胶高温易溶化 不能37C培养琼脂固体 培养基 (1882年)一直沿用至今 方法冗长 结果不稳定 易污染微生物纯培养分离技术纯培养物分离方法固体培养基分离涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离单细胞（孢子）分离选择培养分离涂布平板法1、少量样品加到平板中央（1m

2、L）2、玻璃三角涂棒浸入酒精3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法平板划线法斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在 平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条， 再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物 烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二 次平行划线，再用同法通过第二次平行划线 部分作第三次平行划线和通过第三次平行划 线部分作第四次平行划线。曲线法：将挑取有样品的接种环 在平板培养基上作连续 划线。平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶 化琼脂培养基

3、倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。稀释摇管法适合厌氧菌的纯培养物分离无菌琼脂培养基试管加热 使琼脂熔化后冷却并保持在50左右待分离的菌种用这些试管进行梯度稀释摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后，菌落形成在琼脂柱的中间液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液 体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。单细胞（孢子）分离单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法 从混杂群体中直接分离单个细胞或单个

4、个体进 行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪， 在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取 单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。单细胞（孢子）分离选择培养基分离传统传统选择性培养基选择性培养基血平板：血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。巧克力血平板：巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标 本。中国蓝平板或伊红美蓝平板：中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长， 是较好的弱选择性培养基。麦康凯平板：麦康凯平板：

5、具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。SS琼脂：琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。碱性琼脂：碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。血液增菌培养基：血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。营养肉汤：营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌新型新型显色培养基显色培养基：利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。微生物快速分离、计数方法Petrifilm Plate (3M)微生物快速分离、计数方法3M Petrifilm PlateAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rap

6、id Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate 微生物快速分离、计数方法Compact Dry (NISSUI)微生物快速分离、计数方法Compact Dry (NISSUI)微生物菌种鉴定技术分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）科（Family）属（Genus）种（Spec

7、ies）三界系统发育树三界系统发育树细菌细菌真核生物真核生物古菌古菌“种”微生物基本分类类群种”微生物基本分类类群微生物菌种鉴定技术“种”种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似的定义：一个种（基因型种）是有相似 G+C组成并通过组成并通过DNA杂交试验判断有杂交试验判断有70%或或 更大相似性的菌株的集合。更大相似性的菌株的集合。表征分类表征分类 （Phenotic system ）数值分类数值分类 （Numerical Taxonomy）系统发育分类系统发育分类 （Phylogenetic）多相分类多相分类 （Polyphasic taxonomy）鉴定鉴定 （Identificaiton

8、）根据相似性或亲缘关系根据相似性或亲缘关系 确定分类类群（分类单元）确定分类类群（分类单元）确定新的分离物属于确定新的分离物属于 已知分类单元的过程。已知分类单元的过程。微生物菌种鉴定技术微生物菌种检验微生物菌种检验微生物菌种鉴定微生物菌种鉴定目标菌检验：它是不是某一种菌目标菌检验：它是不是某一种菌?未知菌种鉴定未知菌种鉴定:它是什么菌？它是什么菌？控制菌：控制菌：大肠埃希菌（ Escherichia coli）大肠菌群（Coliform）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）梭菌（

9、Clostridium）白假丝酵母（Candida albicans）致病菌：致病菌：大肠埃希菌（ Escherichia coli） 大肠菌群（Coliform） 沙门菌（Salmonella） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes 阪岐肠杆菌（Enterobacter sakazaki） 致贺氏菌（ Shigella ） 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus） 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni） 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringen

10、s） 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）规范的检测鉴定方法规范的检测鉴定方法 GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40常规鉴定常规鉴定常规鉴定首先掌握菌株的基本特征，如细胞的形状、革兰 氏染色及其他形态学特征；营养类型、需氧性等 生理生化特征。在此基础上查阅分类（鉴定）手册，确定菌株属 于哪一大类（群、组），进行特征测定。根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围，初步确 定科、属。如菌株需鉴定至种，则进一步测定种的鉴别特征。如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因 型在内的全面鉴定。用于鉴定的形态学特征特征特征微生物类群微生物类群细胞形状所有主要类群细

11、胞大小所有主要类群菌落形态所有主要类群超微结构特征所有主要类群染色行为细菌、一些真菌纤毛和鞭毛所有主要类群运动机制滑行细菌，螺旋体内生孢子形状和位置形成内生孢子细菌孢子形态和位置细菌、藻类、真菌细胞内含物所有主要类群颜色所有主要类群用于鉴定的生理生化特征碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物微生物菌种鉴定的问题随着分类学的发展，微生物分类越来越多的以核 酸序列系统发育分析来建立新的分类单元和对原 有分类单元进行调整。产生新的问题：将有越来越

12、多的分类单元不能只 以表型特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能 鉴定。微生物菌种鉴定技术表征（表型）特征表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征遗传（基因型）特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相鉴定技术多相鉴定技术 Polyphasic Identification TechnologyErko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany分子标尺分子标尺微生物菌种鉴定技术伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册Bergeys Manual of Determinative Bacteriology伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细

13、菌学手册 Bergeys Manual of Systematic Bacteriology1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、 1974(8)、1994(9)1984-1989(1)、2001-2010(2)微生物菌种多相鉴定技术基因型鉴定基因型鉴定 技术技术Genotype IdntificationG+Cmol% , RAPD, SSCP, DGGE, LAMP, RFLP, DNA- DNA hybridization, rep PCR, 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA

14、ITS region, -tubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene etc. DNA Barcoding gene sequence analysis, Multi-Locus Sequence Analysis (MLSA) 基因型鉴定技术水平不同指纹图谱和不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平分析技术的鉴定水平2007年年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表新种发表多相鉴定实例多相鉴定实例ATCC16404黑曲霉黑曲霉 Aspergillus niger2008年年ATCC 16404 鉴定

15、为鉴定为Aspergillus brasiliensis sp.nov.2010年年 USP将将ATCC 16404 更名更名2010年年 WDCM 将将ATCC 16404 更名更名图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态 anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensissp. nov., a biseriate black Aspergillusspecies with world-wide distribution. International Journal o

16、f Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932图图:Rep-PCR条码系统发育树条码系统发育树(DiversiLab平台平台) Figure 2: Dendrogram of RepFigure 2: Dendrogram of Rep- -PCR Barcoding (DiversiLab PCR Barcoding (DiversiLab Platform) Platform) . . 注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-1