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1、中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案 由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫 表型已成为诊断急性白血病的重要依据之一。 因准确的诊断需要选择一定数量的 抗体，涉及多个造血系列的抗原。但目前国内甚至国际上没有规范化的方案可以 借鉴。而国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单 位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的 判断。鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经 过多次的讨论， 提出以 CD45/SSC 为基础的中国流式细胞术急性白血病免疫分型
2、四色方案，供参考。本方案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整 及急性白血病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。 1适应范围：适应范围： 1.1 急性淋巴细胞白血病(ALL): ? B 系： 早 B 前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体 B-ALL(Pre-B), 及与Burkitt 淋巴瘤进行鉴别 ? T 系：早 T 前体-ALL (Pro-T), 前体 T-ALL(Pre-T),皮质-T-ALL 和髓质 -T-ALL. 1.2 急性早幼粒细胞白血病（APL） 1.3 急性髓细胞白血病（AML） ? AML 微分化型（AML-M0
3、） ? AML 伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2 和 AML-M4/5） ? 急性红白血病（AML-M6） ? 急性巨核细胞白血病（AML-M7） 1.4 前体树突细胞肿瘤 1.5 急性嗜碱性粒细胞和肥大细胞白血病 1.6 混合表型白血病 1.7 对上诉急性白血病治疗后检测 MRD 的标志进行筛查 2. 抗体的选择抗体的选择：根据检测的目的，需要检测不同的抗体： 2.1 鉴别急性、慢性白血病:对于急性髓细胞白血病，可以根据 CD45/SSC 图型进 行初步判断。髓系白血病细胞 CD45 的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下 方，且多数白血病细胞 SSC 较低（除去大颗粒 APL 患者）
4、。再根据CD34、 CD117、CD38、HLA-DR、CD123 的表达进行判断。急性髓系白血病细胞多数表达 这些标志或只表达这些标志中的部分标志。对于淋系白血病细胞的鉴别，可以根 据 CD34、TDT、CD10，cu 、K/L、cCD3、CD1a（CD99）的表达进行判断。如果 B 淋巴细胞表达 CD34 和或 TDT,则说明为幼稚 B 细胞。CD10 在 B-ALL 中表达较普遍在 部分 T-ALL 中也为阳性，但在 Burkitt 淋巴瘤,滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫大 B 淋巴瘤 (DLBCL)和 B 细胞淋巴瘤未分类型（BCLU）经常为阳性，这些均为周围型淋巴瘤，不表 达 CD34
5、和 TDT。因此，在 CD10+及 CD34 和或 TDT 阴性时，则需要检测 cu 、K/L 鉴别 成熟或幼稚B细胞， 成熟B细胞应该表达膜免疫球蛋白 （Ig及膜轻链Kappa和lambdaL） 。 2.2 鉴别白血病细胞的系列来源： 髓系及淋系 （B、 T 和 NK） 。可参考 2008 年 WHO血液和淋巴系统肿瘤分类中提出的标准。对于 B 系肿瘤细胞，在幼稚细胞比例较 低时，还应该与正常的 B 组细胞进行鉴别。这些正常 B 祖细胞在婴儿，儿童 期比例较高，在成人中一般比例较低，但在淋巴瘤、免疫性疾病，HIV 感染 者、化疗和造血干细胞移植后可出现较高比例的 B 祖细胞，此时应结合临床
6、及免疫表型特点加以鉴别。其鉴别要点，参考 MRD 检测中 LAIP 的表型特 征。 表 1 鉴别白血病的系列性及需要检测的抗体 髓系： 髓系： MPO+(FCM、免疫组化或细胞化学) 或单核细胞分化（至少 2 个标志：NSE、CD11c、CD64、CD14、溶菌酶） T 系: T 系: cCD3(FCM 应用抗抗体。而免疫组化使用的多克隆抗体可与 CD3链结合，非 T 细胞特异的。 或膜 CD3(很少表达） B 系: B 系: 强 CD19 和 CD79a、cCD22、CD10 中至少一个标志强表达 或弱 CD19 和 CD79a、cCD22、CD10 中至少二个标志强表达 2.3 确定白血病
7、的亚型，白血病的亚型在一定程度上反应白血病的分化阶段性， 关于正常细胞的不同分化阶段抗原表达的特点，已有发表的文章参考，在此 不再详细赘述了。 根据正常细胞的分化规律， WHO 提出了对于 B-ALL 和 T-ALL 亚型的分类标准（表 2,3） ，但国际上仍有不同的观点，有学者认为其与预后无明显相 关性， 且其分型抗原的科学性有待研究。 另外， 一些关键性标志， 例如 CD79a, CD22,CD1a 的表达强度可能因使用的抗体不同，而产生较弱的结果，而影响对系列的鉴别。然而， 经普遍征求意见，多数观点认为，本组合应该包括亚型的分类。另外对于 B-ALL 患者还 应该与 Burkitt 淋巴
8、瘤进行鉴别， 对于 T-ALL 亚型的分型， 各各单位可以选择性对其进 行分型，而有文献报道皮质 T-ALL 预后相对较好，可加以鉴别。 表 2 B 系 ALL 亚型分型 亚型 cCD79a CD22 CD19 CD34 TdT CD10 c Ig or K,L 亚型 cCD79a CD22 CD19 CD34 TdT CD10 c Ig or K,L Pro-B-ALL+ + + + + - - - + + + + + - - - Com-B-ALL + + + + + + - - Pre-B-ALL + + + -/+ + + + B-ALL + + + - - +/- + + Com-B
9、-ALL + + + + + + - - Pre-B-ALL + + + -/+ + + + B-ALL + + + - - +/- + + 表 3 T-ALL 亚型分型 亚型 cCD3 CD7 TdT CD34 CD2 CD1a CD3 CD4/CD8 亚型 cCD3 CD7 TdT CD34 CD2 CD1a CD3 CD4/CD8 Pro-T-ALL + + + +/- - - - -/- + + + +/- - - - -/- Pre-T-ALL + + + +/- + - - -/- 皮质-T-ALL + + + - + + - +/+ 髓质-T-ALL + + +/- - + -
10、+ +/-;-/+ Pre-T-ALL + + + +/- + - - -/- 皮质-T-ALL + + + - + + - +/+ 髓质-T-ALL + + +/- - + - + +/-;-/+ 对于 AML-M0，AML 伴髓系（M1/2）和单核细胞分化(M4/5)、红系、巨核细胞分化、 浆样树突细胞白血病和嗜碱和肥大细胞白血病进行诊断和鉴别诊断。需要检测抗体包 括：髓系干/祖细胞标志：CD34,CD117,CD38,HLA-DR；粒系/单核细胞标志：CD15, CD11b, CD13,CD33, CD64,CD14；红系标志：CD71,GLyA 或 CD36；巨核细胞标志： CD41,
11、CD61,CD42b 及树突细胞 CD123,BDCA1(CD1c)，BDCA2(CD303)，BDCA3(， BDCA4(CD304),正常嗜碱细胞表达 CD117（弱） ，CD13，CD33，CD11b,CD123(强)， 不表达 HLA-DR,CD15，CD16，但嗜碱细胞白血病可以表达 HAL-DR，但 CD117 阴性。 肥大细胞表达 CD117（强） ，类胰蛋白酶和 CD25, 原始细胞表达 CD9，部分原始细胞 表细胞核 TDT 和膜 CD22,但其他淋系标志均阴性，可与嗜碱细胞白血病鉴别。 而对于这些白血病的诊断标准，请参考 2008 版造血和淋巴组织肿瘤的 WHO 分类标 准
12、。 2.12.1 确定微量残存白血病（MRD）检测的标志: 由于白血病预后受多种因素的影响。多数 研究证明治疗后 MRD 的监测是判断白血病患者预后的独立预后因素。因此，国内的免 疫分型中应对 MRD 的标志进行筛查，以便治疗后利用 MFC 进行 MRD 监测。MRD 的 检测需要掌握正常细胞不同系列不同分化阶段细胞的抗原的表达顺序和表达强度。因 此，首先要了解所使用的抗体组合中，每个抗原的正常分化规律和表达强度，在此基础 上，对白血病细胞加以鉴别。另外白血病细胞交叉表达交叉系列抗原，因此，需要适当 增加其他系列抗原的检测。 对于 B-ALL 患者，建议监测 CD45、CD10、CD19、CD
13、34、CD38、CD123、CD58 抗原表达的强度变化， 及检测检测交叉系列抗原如 CD13、 CD33 的表达以筛选更多的白 血病相关的免疫表型（LAIP） 。 对于 T-ALL 患者，可以选择 CD34、TdT、cCD3 并结合其他的 T 细胞标志如 CD7， CD3，CD5 等，以检测 BM 或 PB 中的幼稚 T 细胞或异常幼稚 T 细胞，当其比例高于正 常范围时尤其是出现异常幼稚 T 细胞时，请结合临床除外 MRD。 对于 AML,首先观察髓系标志抗原强度是否异常及是否出现早期和晚期标志共表 达，还应检测是否表达淋系标志，如 CD7，CD56，CD19 在 AML 中的阳性率较高，
14、建 议常规进行检测。其他标志 CD5、CD2 表达比例相对低，可选择性应用。 2.22.2 基因型的检测。对于AML和ALL患者，特殊基因型的诊断是非常必要的。WHO的分类 中已将具有特殊预后和临床意义的基因异常的白血病患者进行单独分类。当然这些基因 异常白血病的诊断需要分子生物学和细胞遗传学的方法进行确定。个别基因型的白血病 细胞具有较突出的免疫表型表现，往往提示存在相关的遗传学异常，但不能作为确诊的 依据。例如急性早幼粒细胞白血病（APL）伴t(15;17)（q22;q12）;PML/RAR:典型患者 的免疫表型为： CD34-HLA-DR-SSC大CD117+CD38+CD123+CD9
15、+。 急性髓细胞白血病伴t(8;21) （q22;q22）RUNX1-RUNX1T1. 典型患者的免疫表型为 CD19+CD56+CD33dimCD34+CD117+ 。 Ph+ BCR-ABL+ALL-B: 多 数 患 者 的 免 疫 表 型 为CD34+CD38dim+,CD25+。ALL-B伴MLL重排:免疫表型往往为Pro-B,CD10-CD24-CD15+NG2+。 B-ALL伴t(1;19)(q23;p13.3)； E2A-PBX1: 免疫表型往往为Pre-B, CD19+CD10+ c +。这些标志抗原不作为必做的检测标志，开选择性应用。 2.32.3 预后和治疗靶点:CD20，
16、CD33，CD52，CD45，CD123 等标志可能与预后相关或临床具 有针对某些标志的特异性单克隆抗体药物，对于 2.1-2.3 中未提及的抗原，均不作为必 选标志。 3. 一步法进行免疫分型一步法进行免疫分型+MRD 抗原筛选的参考抗体组合，见表抗原筛选的参考抗体组合，见表 4. 表 4 一步法检测参考的抗体组合 序号 PerCP FITC PE APC B-ALL 1 CD45 CD34 CD10 CD19 确定 B 系及幼稚 B 细胞 2 CD45 TdT CD22 cCD79a CD34-,或 CD19dim 时 3 CD45 Kappa Lambda CD19 选择应用：c+,TDT-,CD34-时 4 CD45 CD58 CD123 CD38 MRD 5 CD45 CD15 cU CD20 分期，基因分型 T-ALL 1 CD45 CD7 CD2 CD5 范 T 标志,T 亚型 2 CD45 CD8 CD4 CD3 鉴别幼稚与成熟 T 3 CD45
