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1、y 鬻确蟹 一一。、赓柬簧擎院硕士学位论文广东湛江二00 六年五月学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。学位论文知识产权声明砌6 6 6本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或
2、扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密后适用本声明。作者签名：坠塑日期： 导师签名：雄日期：6 6 6御6 摘要目的：观察薄荷醇的皮肤刺激性和致敏性；通过体外角质形成细胞( K C ) 培养法测定不同浓度薄荷醇对角质形成细胞乳酸脱氢酶( L D H ) 释放率的影响，并通过电镜扫描了解不同浓度薄荷醇作用下细胞形态结构的变化研究薄荷醇对角质形成细胞的毒性反应；采用流式细胞仪检测不同浓度薄荷醇对角质形成细胞细胞内C a 2 + 浓度的影响来推测其发生机制。依据上述实验结果对溥荷醇皮肤安全性
3、进行评价。方法：I薄荷醇皮肤刺激性试验1 1 急性皮肤刺激性试验家兔随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，实验开始前2 4h 脱毛荠用消毒的针头在家兔背部皮肤作划痕致渗血，制作破损皮肤模型。采用同体左右侧自身对比法，在家兔背部皮肤上均匀涂抹薄荷醇乙醇溶液，并于去除药物后1 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 进行观察红斑和红肿等情况，试验结束后耿各组皮肤进行H E 染色观察皮肤结构改变。1 2 多次给药皮肤刺激性试验实验方法同急性皮肤刺激性试验。每天给药1 次，连续给药7 天，每天观察给药部位红斑、水肿情况。并于给药结束后l h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 进行连续观察，了解
4、皮肤变化情况。试验结束后取各组皮肤进行H E 染色观察受试部位皮肤结构变化。2薄荷醇皮肤过敏试验选取健康豚鼠分组，在其背部皮肤脊柱两侧选取面积为3x3 c m 2 的皮肤，剃毛。于1 d 、7 d 、1 4 d 重复接触薄荷醇乙醇溶液，重复接触后1 4 d 进行激发接触，在激发接触后6 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 后观察皮肤过敏反应情况。3薄荷醇对人角质形成细胞的影响3 1L D H 释放率测定将人角质形成细胞以2 0 X1 0 ；m l 接种于预铺多聚赖氨酸的2 4 孔板，继续培养4 d 后，加入薄荷醇使终浓度呈系列浓度，其中用0 1 二甲基亚砜( D i S O )为溶剂
5、对照，新鲜D M E M 完全培养基作为空白对照。薄荷醇作用2 4 h 后按说明书进行操作，检测细胞内L D H 释放率。3 2 薄荷醇对角质形成细胞形态的影响取不同浓度薄荷醇作用于K c 细胞，2 4 h 后收集细胞，细胞沉淀，离心，弃上清夜，各组加预冷的体积分数为2 5 戊二醛4 m l 固定2 h 后，磷酸盐缓冲液漂沈3 次，梯度酒精依次脱水后制备扫描电镜样本。扫描电镜观察角质形成细胞表面形态的改变。3 3 不同浓度薄荷醇对角质形成细胞内C a ”浓度的影响利用流式细胞仪( F c M ) 结合F i u o 一3 A M 染色技术，半定量检测不同浓度薄荷醇对角质形成细胞内c a “浓度
6、的影响。结果：1 薄荷醇对家兔皮肤无急性皮肤刺激性，病理检查显示不同浓度薄荷醇与溶剂对照组的家兔皮肤解剖结构比较无明显改变。在薄荷醇多次给药皮肤刺激性中，家兔皮肤无明显红斑、水肿，但有诸如鳞屑出现、活动频繁、屈身、尖叫、逃逸等现象；病理检查结果显示从2 浓度组开始出现皮肤结构不同程度的改变。薄荷醇对豚鼠皮肤无致敏性。2 在不同浓度薄荷醇作用下，角质形成细胞的L D H 释放率除浓度为9 5 0 um o l L时，余所有系列浓度薄荷醇作用的K c 细胞L D H 释放率均6 ，4 5 01 1m o l L 1 2 0 0um o l L 组与溶剂对照组存在显著性差异( P 0 0 5 ) 。
7、在浓度为9 5 0um o l L时，其L D H 释放率突然增高，为( 3 3 3 1 8 6 2 ) 。通过电镜扫描发现，除浓度为9 5 0um o l L 组，角质形成细胞表面形态发生凹陷、变形外，其余各组均未发生变化，月组问没有明显的差异。3 与溶剂对照组相比较，除4 5 0 um o l L 浓度组外，其余各组不同浓度薄荷醇作用的角质形成细胞内荧光强度发生右移，且组间存在显著性差异( P 0 0 5 ) W h e nk e r a t i o n o c y t e sw e r ec o n t a c t e dw i t h9 5 0 9 m o l Lm e n t h o
8、 l ，L D Hr e l e a s er a t es h a r p l yi n c r e a s e dt o ( 3 3 3l 士8 6 2 ) T h r o u g he l e c t r o nm i c r o s c o p es c a n n i n g ，n oa b n o r m a l i t yw a so b s e r v e di na l lg r o u p s ，e x c e p tt h e9 5 0 9 m o U Lg r o u p T h e r ew e r ed e p r e s s e dd e f o r m m i
9、o no fk e r a t i o n o c y t e ss u r f a c em o r p h o p o i e s i si nt h e9 5 0 9 m o l Lg r o u p 3 C o m p a r e dw i t ht h ed i s s o l v e n tg r o u p ，e x p e c tt h e4 5 0 9 m o l Lg r o u p ，f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ym o v e dt or i g h tg r a d u a l l yw i t ht h ei n c
10、 r e a s eo ft h em e n t h o lc o n c e n t r a t i o n S i g n i f i c e n td i f f e r e n c ew e r ef o u n da m o n ga l lg r o u p s ( P O 0 5 ；6 表示各组与溶剂对照组比较P 0 0 5A 二三一兰0 1 04 5 07 5 09 5 01 2 0 01 4 1 1 01 6 0 0 D M S O( um o I L 图1 8 不同浓度薄荷醇对K c 细胞L D H 释放率的影响结果显示，溶剂对照组与空白对照组比较，人角质形成细胞L D
11、H 释放率在组间不存在差异显著性( 尸 0 0 5 ) ，说明0 1 D M S O 对角质形成细胞内L D H 释放率没有影响，在本实验中可为合适的溶剂。在不同浓度薄荷醇作用下，角质形成细胞的L D H 释放率除浓度为9 5 01 1m o l L 时，余所有浓度的角质形成细胞L D H 释放率6 ，4 5 0 um o l L 1 2 0 0 um o l L 组与溶剂对照组存在显著性差异( P 0 0 5 ) 。而在浓度为9 5 0 “m o l 1 。时，其I D H 释放率突然增高，为( 3 3 3 1 8 6 2 )。其具体变化如图1 8 。通过电镜扫描发现，除浓度为9 5 0 “
12、m o l L 时，角质形成细胞细胞表面完整，但发生凹陷、皱缩等变化。如图2 3 、2 4 所示，其中变形细胞占制片的5 0 左右；其他浓度组角质形成细胞并未见此种形态改变或其他形态改变( 见图1 9 2 2 、2 5 、2 6 ) 。各组间细胞大小基本相近，组间并没有明显差异，均未见有变形角质形成细胞。I N1 9 空白对照组图2 00 1 D M S O 组图2 14 5 0 1 1 t o o i 浓度组图2 27 5 0 um o l L 浓度组4 2图2 39 5 0um o l L 浓度组幽2 49 5 0um o l L 浓度组图2 51 2 0 0um o l I 浓度组图2
13、61 6 0 0um o l L 浓度组4 3 薄荷醇对角质形成细胞内c a 2 。的影响jj 。；l图2 7空白对照组1a a 口图2 80 1 D M S O 组4 5幽2 94 5 0um o l L 浓度组量幽3 07 5 0um o l k 浓度组io o o图3 19 5 0um o l L 浓度组1 。4 。童图3 21 2 0 0um o l L 浓度组4 7，a 薯，1 )如图2 7 和图2 8 可以看出，与空白对照组相比较，溶剂组荧光强度移动不明现，组间不存在显著性差异( 胗0 0 5 ) ，提示0 1 D M S O 对角质形成细胞c a ”没有明显影响，因此适合作为本试
14、验受试物薄荷醇的溶剂。由图2 7 、2 9 3 2 发现随着薄荷醇浓度的增加，各组荧光强度也随之右移，但是4 5 0 um o l L 组荧光强度右移不明现，与空白对照组相比不存在显著差异性( P O 0 5 ) 。其他各组与空白对照组相比较均存在显著性差异( P O 0 5 ) ，不同组之间两两比较均存在显著性差异( P O 0 5 ) ；且细胞内荧光强度发生右移存在浓度依赖性。结果提示薄荷醇对角质形成细胞内C a ”浓度有一定的影响。5 讨论乳酸脱氢酶( L D H ) 是种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，L D H 即被释放到细胞外，L D H 能够催化乳酸生成丙酮
15、酸，丙酮酸可与2 ，4 一二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯肼，其在碱性条件下呈棕红色，通过比色的方法可反应出细胞释放L D I l 的量，通过比较培养基中L D I - l 和总L D H 量的比例，可反应总细胞中损伤细胞所占的比例”。在浚实验结果中发现9 5 0um o l L 浓度薄荷醇作用于角质形成细胞引起细胞L D H 释放率明显增高，达到3 3 ，而在电镜扫描结果中也同时发现在该浓度下，角质形成细胞大量变形，细胞表面凹陷、皱缩( 5 0 ) ：其他浓度薄荷醇却引起较低的L D H 释放率( 6 ) ，细胞形态的改变也爿i 明显。分析其原因，可能是在该浓度下i F 好启动了某种信号转导
16、通路而引起细胞外形改变、细胞膜通透性发生改变从而造成角质形成细胞的损伤，导致L D H 释放率增高。而且该损伤机制并没有浓度依赖性，其具体原因还有待于进一步研究证实。c a 2 + 是细胞最古老、作用最广泛的细胞信使之一，其是皮肤角质形成细胞内细胞信号传导过程中一个关键的信使，儿乎参与了所有的生物过程，在人角质形成细胞增殖、分化等生理生化反应中均具有重要的调节作用”1 “1 。例如在角质形成细胞角化过程中，c a ”依赖性物质转谷氨酰胺酶和调钙蛋白均受到c a 2 + 不同程度的影响；同时，作为角质形成细胞增殖、分化的最终产物角蛋白形成的过程中，使角蛋白具有不溶性和抵抗性强的特性，催化二硫键的形成的二硫交键酶在c a 2 i 存在下才能正常发挥作用“。也有证明显示c a ”是表皮创伤修复所必须
