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1、 1生物化学大实验 生物化学大实验 （适用于生物技术、生物工程等相关专业） （王吉中，冯昕编写） 食品与生物工程学院 2004 年 5 月 8 日 （适用于生物技术、生物工程等相关专业） （王吉中，冯昕编写） 食品与生物工程学院 2004 年 5 月 8 日 2目 录 目 录 实验一 血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . .1实验一 血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . .1I 血液及组织样品的制备. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1II 蛋白质的沉淀反应. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 4III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3、 . . . . . . . . . . . . . .6 6IV 透析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 9V 蛋白质含量测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4、 . . . . . . . . . . . . . . .1010VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15VII SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1717实验二 血清白蛋白的分离与纯化. . . . . . . . . . . .
5、 . . . . . . . . . . . . .21实验三实验二 血清白蛋白的分离与纯化. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21实验三 种子蛋白质系统分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24种子蛋白质系统分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24I 种子蛋白质含量测定 （凯氏定氮法） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6、 .24. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24II种子蛋白质氨基酸组分分析（氮基酸自动分析仪法）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2626III种子蛋白质组分分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28IV 种子蛋白质亚
7、基分析 （SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30. . . . . . . . . . . . . . . . . . .30实验四实验四 果实菠萝蛋白酶的动力学测定果实菠萝蛋白酶的动力学测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33实验五33实验五 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定. . . . . . . . . . . . . . . . .
8、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38383实验一 血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定 实验一 血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定 I 血液及组织样品的制备 I 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、 脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时 也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法 是保证生化实验顺利进行的关键。 一、血液样品 一、血液样品 (一）采血 测定用的血液，多由静脉采集。一般
9、在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含 量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着 容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。 (二）血清、全血及血浆的制备 1.血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。制备方法是：将刚采集的 血液直接注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经 3h 血块自然收 缩而析出血清；也可将血样放入 37 恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。 为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管 吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。 2.全血及血
10、浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混 合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行 选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。将已抗凝的全二于 2，000r / min 离 心 10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。 血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白 原，其它成分基本相同。 3.抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。抗凝剂种类甚多，实验室常用 的有如下几种，可根据情况选择使用。 （1）草酸钾（钠） 优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草
11、酸 钙，使血液不凝固。每毫升血液用 1-2mg 即可。 配制方法： 配制 10草酸钾水溶液二吸取此液 0.1ml 放入一试管中， 慢慢转动试管， 泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置 80 烘箱烤干（若超过 150 则分解），管壁即 呈一薄层三色粉末，加塞备用。可抗凝血液 5ml 。 此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。对乳酸脱 氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。 4( 2）草酸钾-氟化钠氟化钠 是一种弱抗凝剂。但浓度 2mg / ml 时能抑制血液内葡 萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。 配制方法：草酸钾 6g、氟化钠 3g，溶于 100ml
12、 蒸馏水中。每个试管加入 0.25ml， 于 80 烘干备用。每管含混合剂 22. 5mg，可抗凝 5ml 血液。 此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定；也不能用于淀 粉酶及磷酸酶的测定。 (3） 乙二胺四乙酸二钠盐 （简称 EDTANa2 ) EDTANa2 易与钙离子络合而使血液不凝。 有效浓度为 0.5mg 可抗凝 lml 血液。 配制方法：配成 4 % EDTANa ：水溶液。每管装 0.lml , 80 烘干，可抗凝 5ml 血 液。此抗凝血液适用于多种生化分析。但不能用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。 (4）肝素 最佳抗凝剂，主要抑制凝血酶原转变为凝血酶，从而
13、抑制纤维蛋白原形成纤 维蛋白而凝血：0.1 -0.2mg 或 20 单位可抗凝 lml 血液。 配制方法： 配成 10mg /ml 的水溶液。 每管加 0.lml 于 37-56 烘干， 可抗凝 5-10ml 血液（市售品为肝素钠溶液，每毫升含 12,500 国际单位，相当干 100mg ，故每 125 国 际单位相当于 lmg ) 除上述抗凝剂外，还有柠檬酸钠、草酸铵等，因不常用，故不作介绍。 (三）无蛋白血滤液的制备 测定血液或其它体液化学成分时，样品内蛋白质的存在常常干扰测定。因此，需要 先做成无蛋白血滤液再行测定。 无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，用过滤法或离心法除
14、去 沉淀的蛋白。现介绍几种常用的方法： 1.钨酸法 原理： 钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸： Na2WO4 + H2S04 H2W04十 Na2S04 血液中蛋白质在 pH 值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀： 沉淀液过滤或离心， 上清 液即为无色而透明、pH 约等于 6 的无蛋白滤液。可供非蛋白氮、血糖、氨基酸、尿素、 尿酸及氯化物等项测定使用。 制备方法： (1）取 50ml 锥形瓶 1 只，加入蒸馏水 7 份；（2）用奥氏吸管吸取抗凝血 1 份， 擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。放完血液后，将吸管提高吸 取上清液再吹入，反复洗管 3 次。充分混合，使红细胞完全溶解；( 3）
15、加入 0.333mol/l， 硫酸溶液 1 份，随加随摇，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置 5-10min ，使其 酸化完全；(4) 加入 10 钨酸钠 1 份，随加随摇；(5）放置约 5min 后，如振摇亦不再 发生泡沫， 说明蛋白质已完全变性沉淀。 用定量滤纸过滤或离心 （2,500r/min , 10min) ， 即得完全澄清无色之无蛋白血滤液。 用此法制得的无蛋白血滤液为 10 倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于 0.lml 全血。 试剂：(1) 10 钨酸钠溶液（2) 0.333mol/L 硫酸溶液 52.氢氧化锌法 原理：血液中蛋白质在 pH 大于等电点的溶液中可用 znZ
16、 十来沉淀。生成的氢氧化 锌本身为胶体可将血中葡萄糖以外的许多还原性物质吸附而沉淀，所以此法所得滤液最 适作血液葡萄糖的测定（因为葡萄糖多是利用它的还原性来定量的）。但测定尿酸和非 蛋白氮时含量降低，不宜使用此滤液。 制备方法：(1)取干燥、洁净的 50ml 锥形瓶或大试管 1 支，准确加入 7 份水；(2） 加入混匀的抗凝血 1 份，摇匀；(3）加入 10 硫酸锌溶液 1 份，摇匀；(4）慢慢加入 0.5mol / L 氢氧化钠溶液 1 份，边加边摇，放置 5min ，用定量滤纸过滤或离心（2,500， 10min ) ， 除去沉淀， 便得到完全澄清的无蛋白血滤液。 此滤液亦为稀释 10 倍之血滤液。 试剂：(l) 10 硫酸锌溶液（2) 0.5mol / L 氢氧化钠溶液 3.三氯醋酸法 原理：三氯醋酸为一有机强酸，能使蛋白质变性而沉淀。 制备方法：取 10 三氯醋酸 9 份置于锥形瓶或大试管中，加 1 份已充分混匀的抗 凝血液。
