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1、分类号：R 3 2 2密级：学位类别：科学学位团专业学位口 冒学校代码：1006 2学号：2 0 1 0 6 0 2 0 5 2 学科门类：医学 又辞鼍科袁导硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：I L 2 3 对小鼠黑色素瘤血管生成的影响TIT LE ：I n f l u e n c eo f i n t e r l e u k i n - 2 3o na n g i o g e n e s i si nm o u s em a l i g n a n tm e l a n o m a一级学科：基础医学二级学科：人体解剖与组织胚胎学论文
2、作者：房东亮指导教师：马跃美教授导师组成员：张丹芳副教授天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名学位论文版权使用授权书日期洲诲瑚汐日本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和
3、借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密 7 。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者导师签日期：p 1 ) 年珀沙日日期：I ；m 3 - J 目夕日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目前，关于慢性炎症与肿瘤之间的关系己达成比较一致的认识，慢性炎症不仅作为一些肿瘤发生的土壤，而且在与肿瘤共同存在时，它还会作为一种促进肿瘤发展的因素。慢性炎症与肿瘤相关炎症有许多相似之处，如固有免疫细胞的浸润、基质金属蛋白酶活性升高、血管生成和微血管密度提高，从而，依赖肿瘤浸润性T 细胞或内皮淋巴细胞细胞毒性的免疫系统监督功能增强，是早期抑
4、制肿瘤发展的关键。炎症反应过程如血管生成和巨噬细胞、中性粒细胞的浸润是细菌感染的有效防御机制，但是这个调节通路似乎对于肿瘤的预防并不合适，反而为肿瘤提供了一个保护性环境，其中细胞因子的表达不仅能帮助组织重建和血管生成，还能保护肿瘤免于免疫系统的抵抗。因此，慢性炎症在与肿瘤共存环境中对其产生的作用，与炎症部位细胞因子的释放密切相关。本研究在实验室前期建立慢性炎症黑色素瘤复合动物模型的基础上，对小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子的含量进行了检测，结合对肿瘤组织中微血管的计数，分析白细胞介素( I L ) 6 、I L 1 7 、I L 2 3 、血管内皮生长因子( V E G F ) 与肿瘤组织中
5、微血管密度( M V D ) 的相关性，并选取炎症因子I L 2 3 进行体外实验，观察其对B 1 6 F 1 0 细胞增殖、迁移、侵袭以及血管生成拟态能力的影响，主要研究内容如下：第一部分：小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量的检测与分析本部分研究选取小鼠血清( 取自实验室前期建立的慢性炎症黑色素瘤复合动物模型) 作为检测对象，通过酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 对其中部分细胞因子进行检测与分析，结合前期实验中对肿瘤组织进行的微血管计数进行了相关性分析。得出结果如下：炎症肿瘤组小鼠血清白细胞介素( I L ) 一6 、I L 一1 7 、I L 一2 3 、血管内皮细胞生长因子
6、( j G F ) 均明显大于单纯肿瘤组( 尸 0 0 5 ) 。根据以上实验结果，结合关于上述三种白介素类炎症因子与肿瘤发生发展关系的研究现状。目前达成的共识为：I L 一2 3 可以通过增强机体免疫功能产生天津医科大学硕士学位论文I F N 小T N F a 等发挥抗肿瘤效应；I L 2 3 通过调节免疫监视等功能，对肿瘤微环境中的免疫系统进行编辑，打破机体平衡状态，起到诱导肿瘤发生的作用。而关于I L 2 3 与肿瘤血管生成方面的研究关注度相对不够，因此，本研究选取I L 2 3作为下一步体外实验的研究对象。第二部分：I L 2 3 对小鼠黑色素瘤细胞体外增殖、迁移、侵袭以及管道形成能力
7、的影响为了进一步观察单一炎症因子对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及管道形成能力的影响，本部分选择I L 2 3 和小鼠来源的黑色素瘤B 1 6 F 1 0 细胞进行体外实验研究，通过培养肿瘤细胞，施加I L 2 3 进行作用，观察其对B 1 6 F 1 0 细胞增殖、迁移、侵袭及管道形成能力产生的影响。四甲基偶氮唑盐( M T T ) 比色法实验结果表明：I L - 2 3 干预组肿瘤细胞增殖率高于对照组，O D 值差异具有统计学意义( 尸 0 0 5 ) ，天津医科大学硕士学位论文一、小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量的检测与分析+ P O 0 5 ，”P 0 0 1表2 三组小鼠血清中I
8、L 1 7 含量的比较尸 0 0 5 ，“P 0 0 17天津医科大学硕士学位论文一、小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量的检测与分析+ P 0 0 5 ，“尸 0 0 1表4 三组小鼠血清中V E G F 含量的比较P 0 0 5 ，”P 0 0 18天津医科大学硕士学位论文一、小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量的检测与分析1 2 2 血清中I L 6 、I L 1 7 、I L 2 3 、V E G F 含量与肿瘤组织M V D 的相关性分析通过对小鼠血清中四种细胞因子的含量进行检测，结合肿瘤组织微血管计数，对细胞因子的含量和微血管的数目进行相关性分析，结果如图1 所示：I L 6
9、、I L 1 7 、I L 2 3 、V E G F 均与M v D 呈正相关( r 分别为0 6 8 8 、O 7 5 9 、0 6 5 2 、0 7 4 6 ，P 0 0 5 或P 0 0 1 ) 。国图1 四种细胞因子与M V D 的相关性I L 6 、I L 1 7 、I L 2 3 、V E G F 均与M V D 呈正相关( r 分别为0 6 8 8 、0 7 5 9 、0 6 5 2 、0 7 4 6 ，P 0 0 5 或P O 0 1 ) 。1 2 3 血清中I L 6 、I L 1 7 、I L 2 3 与V E G F 含量的相关性分析通过对I + T 组小鼠血清中4 种细
10、胞因子的含量进行分析，发现I L 1 7 、I L 2 3的水平与V E G F 呈正相关( r 分别为0 8 4 1 、0 8 1 7 ，均P 0 0 1 ) ，如图2 所示。9天津医科大学硕士学位论文一、小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量塑堑型量! 逝图2I L 1 7 、I L 2 3 与V E G F 的相关性I L 1 7 、I L 2 3 的水平与V E G F 呈正相关( r 分别为0 8 4 1 、0 8 1 7 ，均P O 0 1 )1 3 讨论1 3 1 慢性炎症过程中部分细胞因子的释放促进了恶性黑色素瘤血管的生成组织器官在慢性炎症长期反复的刺激下，具有发生恶变的潜在可
11、能性。慢性炎症过程中产生的生长因子和细胞因子可以促进炎症部位的血管生成和组织结构的重建。然而，肿瘤组织中的炎细胞及细胞因子却可以促进肿瘤的生长，侵袭并抑制宿主免疫系统的肿瘤防御能力【l ，10 1 。本研究通过建立荷瘤小鼠的慢性炎症模型，结果显示炎症肿瘤复合模型组的移植瘤生长速度、M V D 及血清中I L 6 、I L 1 7 、I L 2 3 及V E G F 的含量均大于单纯肿瘤组，提示慢性炎症可能通过某些细胞因子的释放从而促进肿瘤的生长及肿瘤血管的生成。在慢性炎症与黑色素瘤相互作用过程中，慢性炎症是如何发挥促进肿瘤作用的，U m a n s k y ，V 1 l 】等认为克服免疫抑制是
12、慢性炎症在复合模型中发挥作用的关键。M e y e r ，C 【1 2 】等的研究结果显示I L 1 8 、G M C S F 、I F N - ，、等炎症因子介导的免疫反应抑制了黑色素瘤的发生发展。在对患有黑色素瘤且己发生转移的病人研究中发现，血清I L 4 、I L 5 、I L 一1 0 、I L 1 3 水平明显高于正常个体【l3 1 ，且V E G F 的水平与上述炎症因子的水平密切相关，明显影响到患者的预后，暗示了炎症因子介导的V E G F 释放对肿瘤的发展具有十分重要的意义【1 4 。众多的研究报道与本实验结果相符且能够支持本研究的继续进行。1 3 2 炎症过程中V E G F
13、 的高表达促进了恶性黑色素瘤微血管的生成新生血管的形成以及异常血管结构的建立与肿瘤的发生密切相关。一方面，肿瘤组织中的大量血管为肿瘤细胞提供养分，促进肿瘤生长；另一方面，血管为肿瘤细胞1 0天津医科大学硕士学位论文一、小鼠血清中部分肿瘤发展相关细胞因子含量的检测与分析进入血液循环、进而发生血道转移提供通路。因此，血管生成是肿瘤病程进展中的一个关键环节【1 5 】。V E G F 是调控肿瘤血管生成的核心因子。多种信号途径，如炎性环境、生长因子、癌基因、细胞因子和激素等均可以促进V E G F 分泌。在很多慢性炎症性疾病中，如慢性前列腺炎、慢性结肠判17 1 、慢性肝炎等，患者血清V E G F
14、 含量均明显升高。黑色素瘤是一种血运极其丰富的恶性肿瘤，新生血管的状况与肿瘤的发生发展密切相关。在慢性炎症与黑色素瘤共存于小鼠体内时，炎症肿瘤组小鼠血清V E G F 明显大于单纯肿瘤组与正常小鼠，且相关分析结果显示，V E G F 的升高与M V D 具有较好的相关性，据此初步推断炎症肿瘤组小鼠血清V E G F 的高表达可能通过某种作用促进了黑色素瘤血管的生成。在J o h n s o n , K E 【1 9 】等对非黑色素瘤皮肤癌的研究中，他们认为V E G F 的高表达不仅从炎症过程中促进血管的构建，而且V E G F 可以对黑色素瘤细胞产生直接的作用，通过增强肿瘤细胞的干性、促进增
15、殖、增强其存活能力，从而直接促进肿瘤血管的生成。Y a n g ，L 1 2 0 等在V E G F 对黑色素瘤血管生成的影响研究中，发现G 蛋白偶联受体5 6 能够调节V E G F 的分泌，继而明显影响到黑色素瘤的血管生成。T a n ，W 2 l 】等在对慢性饮酒与黑色素瘤发生发展的研究中发现，+ 长期饮用酒精的小鼠其肿瘤血管密度明显高于饮用清水的小鼠，E L I S A 结果显示V E G F的浓度要远远高于饮用清水的小鼠。无论是理论依据还是研究报道，都说明V E G F 会明显促进黑色素瘤血管生成，且一些慢性炎症对V E G F 的表达有明显的促进作用。1 3 3 炎症因子的释放与V
16、 E G F 的高表达具有一定的关联弗氏佐剂诱导的慢性炎症是一种特殊的慢性炎症，以肉芽肿的形成为特点，多种炎症因子能够在此部位分泌，如I L - 1 、I L - 6 、I L 8 、肿瘤坏死因子( T N F ) 、粒细胞集落刺激因子( G C S F ) 、巨噬细胞集落刺激因子( M C S F ) 等。这些炎症因子在正常的炎症过程中促进炎细胞浸润、诱导血管生成、提高基质金属蛋白酶活性，是炎症发生过程中不可或缺的参与者。而在肿瘤部位血管生成的增加、基质金属蛋白酶活性的升高，却成了肿瘤生长的保护伞。本研究显示炎症肿瘤组和单纯肿瘤组小鼠血清中I L - 6 、I L - 1 7 、I L 2 3 含量均明显高于正常小鼠，且炎症肿瘤组更为突出。研究已证实，慢性炎症过程中，肿瘤相关巨噬细胞可以通过分泌V E G F和转
