《CD44反义寡核苷酸抑制胃癌细胞SGC7901粘附侵袭的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CD44反义寡核苷酸抑制胃癌细胞SGC7901粘附侵袭的实验研究（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学硕士学位论文CD44反义寡核苷酸抑制胃癌细胞SGC7901粘附侵袭的实验研究姓名：崔越宏申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：徐惠绵20020501中文摘要目的胃癌是常见恶性肿瘤，是消化系最多发肿瘤。在我国，胃癌的发病率及死亡率均居恶性肿瘤之首。癌的侵袭及转移是癌患者治疗失败的主要原因，大约3 0 新诊断的实体瘤患者已有临床上可见的转移灶。因此，如何防止及治疗侵袭与转移成为癌治疗研究的焦点之一。进展期胃癌根治术后腹膜种植性转移约占4 0 5 0 ，是影响预后的主要原因之一。目前与腹膜转移相关的粘附分子中较为肯定的是C D 4 4 和整合素，C D 4 4 是一种分布极为广泛的细胞
2、表面跨膜糖蛋白，主要介导细胞一细胞、细胞一基质之间的粘附，干扰C D 4 4 与其配体之间的相互作用，将为抑制肿瘤的生长转移提供新的治疗靶点。反义技术的基本原理是根据碱基互补原则，用人工 合成或生物体表达的特定互补的D N A 或R N A 片断( 反义核酸)以抑制或封闭专一靶基因表达的技术。随着研究的不断深入，硫代磷酸二酯寡核苷酸因其具有水溶性、核酶裂解稳定性以及易于大量人工合成的优点，成为目前最成功的第一代寡核苷酸替代物；采用脂质体携带寡核苷酸进入细胞后，可保护其不被核酶降解，使反义寡核苷酸在细胞核的作用时间延长，改变了其在细胞内的分布。卜本研究针对C D 4 4 的基因序列设计一段特异的
3、寡核苷酸，观 察高转移细胞系S G C 7 9 0 1 用反义寡核苷酸作用后m R N A 、蛋白表达水平的变化，继之检测粘附力、侵袭力的变化，透射电镜观察细胞形态学的变化，从而证实反义技术是阻断转移的有效途径。f 方法S G C 7 9 0 1 细胞用含1 0 胎牛血清的D M E M 培养液培养，以B i o t i n 标记的C D 4 4 反义寡核苷酸( a s O D N ) 配合组织细胞化学方法观察转染后其在细胞内的分布，并用免疫组化的方法检测是否有蛋白表达的变化，然后用脂质体将C D 4 4a s O D N 转染S G C 7 9 0 1胃癌细胞系，通过l i t P C R
4、、流式细胞术、M T Y 法、聚碳酸酯膜侵 袭试验分别测定C D 4 4 m R N A 和细胞表面C D 4 4 蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化，透射电镜观察超微结构，统计分析采用S P S S l 0 0 软件行配对计量资料t 检验。结果1 生物素标记的C D 4 4a s O D N 转染S G C 7 9 0 1 细胞3 小时，未 见胞浆及胞核内出现明显变化，6 小时才见细胞内出现浅棕色颗粒；2 从免疫组化的结果可以看出转染3 6 小时后细胞C 1 3 吗4 蛋白表达有所下降；3 R T P C R 结果显示a s O D N 组C D 4 4 f l a c t i nm R
5、N A 相对定量比值( 0 6 4 1 - t - O 0 8 4 ) 较对照组( 0 8 9 4 0 1 2 0 )显著降低( P 戳抑糕或封闭专靶基因表达的技术。大量研究证熨了反义寡核苷酸特异经搀裁基因表这的能力。反交寡核蕾簸能够发挥作用必蒺满遵以下条件：觉分的细胞虑浓度，较长的细胞蠹半衰期，具礴对抗爨 浆、俸液及细胞内核酶降解的能力。硫代磷酸二酯寡核替酸是日蘩最戒功的第一钱寡核萤酸替健麴，嚣冀最蕤海蝰寡魇簏，嚣具宿水溶性、核酶裂解稳定性以及易于大量人工含成一J 。另外，能否有效鹣穿过缨蕤黢是爱义寡核瞢簸研稍成稿藤治疗耀药羽一个关 键因索，脂殿体的应用较为广泛，脂质髂可携带各释基因片段，保
6、护基因不被核酶降解，并且腊质与细胞膜融合将目的基因导入细腱后，置肇爱鼯投降勰，两昼反义寡核营酸与是筹囊体结舍后，其主簧 集中程细胞核，使反义寡核诗酸在细胞核的作用时间延长。脂质体技术也在改进，翔偶联上精赫基的鬻离子镕爵震体，使得缁施摄取率显著提高引。凑研究表明反义寡接替酸能增加肿瘤缨胞对讫疗的敏摩蘸，如用C m y b 反义寡核苷酸增加了入缩肠癌细胞对 颓铑瓣黢感性，燕融- 2 反义方法增燕了器穗黑龟素瘩豁纯疗敏感性，用脂质体Ce r bB 2 反义脱氧寡核黄酸可影响人舜巢癌裸鼠掰膜移植癌：敷长及纯疗敏感往。现融厢炭必核背酸柞抗艾滋t2 病治疗，反义核苷酸可对多聚酶( 或逆转录酶) 起非特异性
7、抑制作 用，又可有顺序特异性地与基因的D N A 两条链形成三链，或与m R N A 杂交，阻止其表达，最终亦可阻止肿瘤生长k “。反义寡核苷酸将成为治疗恶性肿瘤的新型药物已为学者们所共识，相信 随着研究的深入和存在问题的不断解决，反义核酸有望成为临床恶性肿瘤治疗的有效手段，可能会使一些“不治之症”成为历史。 近年来人们对C D 4 4 基因的功能、结构、产物倍感兴趣。因为C D 4 4 基因所编码的是相应的C D 4 4 粘附性细胞表面糖蛋白，它广 泛地存在于不同组织与细胞系的表面。由于粘附性糖蛋白与转移 关系密切，所以在某些肿瘤中C D 4 4 被认为是一种肿瘤转移基因3 “引。大量文献证
8、明C D 4 4 在胃癌组织中有高表达“，本实验曾用间接免疫荧光的方法证实了S G C 7 9 0 1 细胞表面有C D 4 4 蛋白的高表达，而且是功能性蛋白，因为表达C D 4 4 的S G C 7 9 0 1 细胞可 以粘附和侵袭细胞外基质。因此本研究引入一段针对C D 4 4 基因 序列的部分硫代修饰反义寡核苷酸，首先应用组织细胞化学和免 疫组化的方法摸索出转染时间和转染后培养时间，并从m R N A 和蛋白水平观察反义寡核苷酸对C D 4 4 基因的封闭作用，然后研究癌细胞粘附力、侵袭力的变化。结果表明：转染6 小时脂质体可将寡核苷酸带入细胞，培养4 0 小时其结构可发生相应的变化，
9、C D 4 4的硫代a s O D N 经脂质体导入细胞后，其基因表达明显受到抑制，翻译的蛋白质产物，即细胞表面C D 4 4 蛋白表达水平显著下降，由于蛋白表达的下降，导致细胞功能方面发生相应的改变，细胞与细 胞外基质的粘附和侵袭能力均有所下降。细胞粘附既有连接结构参与，也有粘附分子作用。细胞粘附既是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。粘附在癌细胞侵袭转移过程中有重要作用，首先癌细胞从原发瘤的母体分离就与癌细胞同质粘附降低有关，癌细胞与肿瘤间质细胞和基质粘附的改变也是有利于转移的重要2 1 因素。其次，在血管内同质或异质瘤栓形成，也
10、是粘附的结果。第三，瘤细胞游出血管过程中，与血管内皮及其下的基底膜异质粘附是转移过程的重要步骤“。而r O D N 作用后的缅胞各项生化指标却接近未加药的空白对照组，表明此段部分硫代修饰的反义寡核苷酸具有很强的特异性，可能成为一种非常有效的抗肿瘤药物。 a s O D N 作用后癌细胞在形态上的变化主要是细胞表面的伪足减少，肿瘤细胞的运动能力与细胞形态尤其是伪足密切相关，研究认为，丝状伪足末端的分叉结构在侵袭中有重要作用。当瘤细胞与靶组织接触和进入周围组织的细胞间隙时，丝状伪足可牢固的粘附于靶组织或细胞，所以癌细胞在侵袭早期，其丝状伪足起主要作用，这是原位运动主要表现形式之一“。本实验中细胞表
11、面C D 4 4 蛋白表达的下降，引起癌细胞粘附与侵袭能力的降低。M e r z a k 等“ o 从C D 4 4 核酸序列中选出了两个特异的正义和反义寡核苷酸，正义寡核苷酸对神经胶质瘤细胞系 的侵袭几乎没有影响，仅对G O G C C M 和G O G U V W 细胞株有2 0 的抑制，这个结果可解释为正义寡核苷酸只对C D 4 4 转录有部分影响，而反义寡核苷酸则对五种神经胶质瘤细胞的侵袭完全抑制。H a r a d a 等8 1 将反义C D 4 4 sc D N A 序列转染入结肠腺癌细胞系L S l 7 4 T 中，结果表明转染后的细胞粘附力与侵袭力均有明显下降。总之，应用C D
12、 4 4 反义寡核苷酸能有效抑制S G C 7 9 0 1 细胞C D 4 4 表达，降低其粘附侵袭性。本实验所用的粘附与侵袭系统将为肿瘤转移机制研究提供一个有效的模型。结论1 脂质体确实能把硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸转染入 S G C 7 9 0 1 细胞。2 C D 4 4 反义寡核苷酸转染S G C 7 9 0 1 后可降低其m R N A 及2 2 蛋白表达水平，从而降低其对细胞外基质的粘附和侵袭，效果优于随机序列寡核苷酸组。3 对照组及r O D N 组表面有很多微绒毛及球状突起，大小不 一，形态各异；a s O D N 组表面微绒毛及球状突起减少，细胞表面较光滑，这也与其相应的功能
13、变化有关。2 3 本研究新见解反义技术是肿瘤基因治疗策略之一，其中反义寡核苷酸因制备容易而得到广泛应用。C D 4 4 和整合素是与胃癌转移有关比较肯定的粘附分子，但其反义寡核苷酸在胃癌抗粘附侵袭治疗中的应用尚未见报道，本实验旨在探寻能用于临床的一种高效低毒的基因治疗方法。2 4 参考文献1 孙燕主编内科肿瘤学j 匕京：人民卫生出版社，2 0 0 1 ，P 5 4 9 5 7 2 2 T h o m a sS t r o b e l ，S t e p h e nA C a n n i s t r a B 1 一I n t e g r i np a r t l ym e d i a t eb i
14、 n d i n go fo v a r i a nc a n c e l “ c e l l st op e r i t o n e a lm e s o t h e l i u mi nv i t r o G y n e c o l o g i cO n c o l o g y ，1 9 9 9 ，7 3 ：3 6 2 3 6 7 3 S a k a k u r aC ，H a g i w a r aA ，N a k a n i s h iM ，e ta 1 D i f f e r e n t i a lg e n ee x -p r e s s i o np r o f i l e so
15、 fg a s t r i cc a n c e rc e l l se s t a b l i s h e df r o mp r i m a r yt u r n o u ta n dm a l i g n a n ta s c i t e s B rJC a n c e r ，2 0 0 2 ，8 7 ：1 1 5 3 1 1 6 1 4 T h o m a sL ，J o h nA M e l a n o m ac e l l sm o t i l i t yo nh a y l u r o n a t ei sm e d i a t e db yC I M 4 H C l i nE
16、x pM e t a s t a s i s 。1 9 9 2 ，1 0 ：1 7 2 3 5 B e l t i n g e rC ，S a r a g o v lH U ，S m i t hR M ，e ta 1 B i n d i n g ，U p t a k e ，a n dI n t r a e e U u l a rT r a f f i c k i n go fP h o s p h o r e t h i o a t e m o d i f i e d0 l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s JC l i nI n v e s t ，1 9 9 5 ，9 5 ：1 8 1 4 1 8 2 3 6 D e s j a r d i n sR ，K r z y s t y n i a kK ，T h e r i e nH M ，e ta 1 I m m u n o a c t
