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1、标签蛋白融合技术概述： 从分子生物学基础和生化基础到商用系统标签蛋白融合技术概述： 从分子生物学基础和生化基础到商用系统 M I N I - R E V I EWK. Terpe 摘要：摘要： 随着蛋白质组学的迅猛发展，重组蛋白质的使用在近年来大大增加。重组杂合体含有一 个多肽融合担体也就是亲和标签可用于辅助目标蛋白的纯化，这已经被广泛使用。许多不同的 蛋白质，结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于重组蛋白纯化和检测这个 优点被广泛赞同。然而，很难选择正确的纯化系统用于特定的目标蛋白。本综述概述了使用最 频繁的和有趣的系统：精氨酸标签（Argtag），钙调蛋白结合肽（calmod
2、ulin-binding peptide），纤维素结合结构域（cellulose-binding domain），DsbA，c-myc-tag，谷胱甘肽S 巯基转移梅（glutathione S-transferase）, FLAGtag,HAT-tag, His-tag, 麦芽糖结合蛋白 （maltose-binding protein）, NusA, Stag,SBP-tag, Strep-tag,和硫氧还蛋白等。 引言 引言 生产高度纯化和性状确切的重组蛋白质已成为在医药工业工作的蛋白质化学家的主要任务，近 年来，一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质。这些亲和标签系统具有
3、以 下特征：（a）一步的吸附纯化，（b）对三级结构和生物活性影响小，（c）可方便且专一的去 除以产生天然蛋白质，（d）在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确，（e）适用于大量的不同 蛋白质。然而，每一个亲和标签都在其特定的缓冲液条件下纯化得到（表1）。因此有几种不同 的策略用于大规模生产重组蛋白质。其中一种办法是使用很小的肽标签，这些标签不会与融合 的蛋白质发生干扰。 使用最为广泛的有多聚精氨酸， FLAG-， 多聚组氨酸-, c-myc-, S-, and Strep II-tag. 对于某些应用，小标签无需去除。这些标签不像大标签具有免疫原性，经常可以直接 作为抗原用于产生抗体。 小标签对于融
4、合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置 和氨基酸组成 (Bucher etal. 2002)。另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合担体。大 担体的使用可以增加目标蛋白的溶解性。缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等，标签必须 加以去除。 一般来说， 对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统。 这取决于目标蛋白本身(如 稳定性，疏水性)，表达系统，纯化后蛋白的用途。本综述概述了使用最频繁的和有趣的标签- 蛋白融合系统（表2）。 多聚精氨酸标签(Arg-tag) 多聚精氨酸标签(Arg-tag) 精氨酸标签最早在1984年首次描述(Sassenfeld和 Brewer 1984)，通常
5、由5或6个精氨酸组成。 它已被成功用作细菌C末端标签，产生的重组蛋白质纯度高达95，得率达到44。精氨酸是碱 性最强的氨基酸，带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大 部分杂蛋白不结合。结合后，带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到。当C末端 为疏水性区域时，多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构(Sassenfeld和Brewer 1984). 来自 Pyrococcus furiosus的带精氨酸标签的麦芽葡聚糖结合蛋白已获得结晶(Bucher et al.2002)。 天然蛋白质的晶体在视觉上是分辨不出差别的，然而晶体在镶嵌图案和衍射图
6、谱上有差别。精 氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除。这一酶促处理已被成功用于一些例子，但常常由 于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制(Nagai和 Thogerson 1987)。精氨酸标签可用于在扁平表面固定化功能蛋白质；这对于研究其与配体的相互作用是重 要的。GFP在其末端加上6个精氨酸标签可以通过这一序列可逆、专一结合到云母的表面，这已 经作为电子扫描电镜应用的标准底物（Nock et al.1997）。 然而精氨酸标签并不常用，与第 二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具。 多聚组氨酸-标签(His-tag) 多聚组氨酸-标签(His-tag) 已广泛采用
7、的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和 标签的重组蛋白质。固定化金属螯合层析（ IMAC; 由Porath et al. 1975提出）的基础是固定 在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用。组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸，组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子 形成配位键。含有连续组氨酸残基序列的肽类可在IMAC中有效保留。基质材料洗涤之后，可通 过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类(表 1)。纯化带组氨酸残基的蛋白质的方法首次于1987年提出（Hoch
8、uli et al. 1987）。Hochuli开发了亚硝基三乙酸 (NTA)吸附剂用于金属螯合亲和层析。NTA 树脂形成四齿的螯合物，非常适合与金属离子形成6 价配位键，2价用于可逆保留生物高分子。带有多聚组氨酸标签的二氢叶酸还原酶在1988年通过 Ni2+-NTA基质成功分离(Hochuli et al. 1988)。这一系统的纯化效率取决于多聚组氨酸的长度和溶解系统(表 3)。 虽然在变性条件下系统对于带6个组氨酸标签的蛋白质纯化有效，带3个组 氨酸标签的蛋白质在生理条件下可有效纯化。然而带6个组氨酸标签的蛋白质可以在天然条件 下、在低或高浓度盐的缓冲液中结合到Ni2+-NTA 基质上。
9、结合后，目标蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脱。低浓度的咪唑（如0.8 mM）可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一吸附。6 个组氨酸标签的蛋白质可用20到250mM咪唑浓度范围洗脱 (Hefti et al. 2001；Janknecht et al.1991)。 使用咪唑的缺点是咪唑会影响NMR试验，竞争性试验研究和晶体学试验，咪唑的存 在经常导致蛋白质的聚集(Hefti et al. 2001)。另一种用于纯化多聚组氨酸标签蛋白质的材料 是TALON。这由Co2+-羧甲基天冬氨酸(Co2+-CMA)组成，并偶联到固相的树脂上。TALON使得标签蛋白在温和条件下洗脱，已有报导与Ni2+
10、-NTA树脂相比，其非特异性蛋白结合更少，从而达到更高的洗脱产物纯度(Chaga et al. 1999a, b)。一种酶制剂通过SDS-PAGE鉴定的纯度高于95。利 用Co2+-CMA纯化可以使用的天然多聚组氨酸亲和标签长达19个氨基酸残基(HAT-tag;序列见表2) 。 氯霉素乙酰基转移酶, 二氢叶酸还原酶和绿荧光蛋白在N末端加入HAT标签可在温和条件下 一步纯化纯度大于95。平衡缓冲液和上样缓冲液中添加5mM 咪唑去除结合较弱的非专一蛋白 质吸附，而用150mM 咪唑洗脱HAT标签的蛋白质。也可降低pH到5.0洗脱标签的蛋白质。与盐酸 胍相比，尿素对于HAT标签蛋白质结合力的降低作用
11、更强。然而HAT标签蛋白的过量表达试验仅 在细菌中获得证实。多聚组氨酸亲和标签通常置于重组蛋白质的N端或C端。最佳的标签放置位 置是针对特定的蛋白质而言的。纯化多聚组氨酸标签蛋白已成功用于大量的表达系统包括细菌 (Chen 和 Hai 1994； Rank et al.2001)， 酵母(Borsing et al. 1997； Kaslow和 Shiloach 1994)，哺乳细胞 (Janknecht et al. 1991； Janknecht 和 Nordheim 1992), 以及杆状病毒 感染的昆虫细胞(Kuusinen et al. 1995；Schmidt et al. 199
12、8)。超过100种结构的组氨酸标 签蛋白质登记在蛋白质数据库中（Protein Data Bank）。 具有组氨酸标签的蛋白质在镶嵌图 案和衍射图谱与天然蛋白相比变化不大(Hakansson etal. 2000)。虽然多聚组氨酸亲和标签因 为相对较小且带电荷而几乎不影响蛋白质的活性，但是通常并不能排除亲和标签影响其蛋白质 活性的可能(Wu 和Filutowicz 1999)。将亲和标签移到另一端(Halliwell et al. 2001)或者在 变性条件下进行纯化可以解决这个问题。由于金属离子可吸附到NTA树脂，带金属离子中心的蛋 白质不推荐用该法纯化。由于Ni2+-NTA可被还原，在厌氧
13、条件下也不推荐使用该办法。然而利用组氨酸标签纯化蛋白质是通常使用的办法。 表1 亲和标签和基质洗脱条件 亲和标签 基质 洗脱条件 Poly-Arg 阳离子交换树脂 在碱性pH8.0 NaCl线性梯度0 400mM Poly-His Ni2+-NTA, Co2+-CMA （Talon） 150 mM 咪唑或低 pH FLAG Anti-FLAG 单抗 pH 3.0 或 25 mM EDTA Strep-tag II Strep-Tactin (修饰的链球菌抗 生物素蛋白) 2.5 mM 脱硫生物素 c-myc 单抗 低pH S RNaseA酶 的S片断 3M硫氰酸胍， 0.2M 柠檬酸pH 2，
14、3M 氯化镁 HAT (天然组氨酸亲 和标签) Co2+-CMA (Talon) 150 mM 咪唑或低 pH 钙调蛋白结合肽 钙调蛋白 EGTA 或1 M NaCl中加 EGTA 纤维素结合结构域 纤维素 1型：盐酸胍或者尿素大于4M 2/3型：乙二醇 SBP Streptavidin（链球菌抗生物素 蛋白） 2 mM 生物素 壳聚糖结合结构域 壳聚糖 内含子融合： 3050mM 二硫苏糖醇, 巯基乙醇，或半胱氨酸 谷胱甘肽S巯基转 移酶 谷胱甘肽 510mM 还原型谷胱甘肽 麦芽糖结合蛋白 交联淀粉 10mM 麦芽糖 表2 亲和标签的序列和大小 标签 残基 序列 大小 （KDa） Poly
15、-Arg 5-6 (通常5个) RRRRR 0.80 Poly-His 210 (通常6g) HHHHHH 0.84 FLAG 8 DYKDDDDK 1.01 Strep-tag II 8 WSHPQFEK 1.06 c-myc 11 EQKLISEEDL 1.20 S 15 KETAAAKFERQHMDS 1.75 HAT 19 KDHLIHNVHKEFHAHAHNK 2.31 3x FLAG 22 DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK 2.73 钙调蛋白结合肽 26 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL 2.96 纤维素结合结构域 27189 结构域 3.00 20
16、.00 SBP 38 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP 4.03 壳聚糖结合结构域 51 TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWE PSNVPALWQLQ 5.59 谷胱甘肽S-巯基转 移酶 211 蛋白质 26.00 麦芽糖结合蛋白 396 蛋白质 40.00 表3 在6M盐酸胍和0.05M磷酸盐缓冲液中对于Ni2+-NTA吸附剂的亲和力(Hochuli et al.1988) 磷酸 盐 盐酸胍 截留(%) 洗脱(%) 截留(%) 洗脱(%) 多聚组氨酸二氢叶酸还原酶 (His)2-DHFR 30 10 90 30 10 10 (His)5-DHFR 90 20 50 50 (His)6-DHFR 90 10 90 90 DHFR-(His)290 90 90 80 90 50 10 10 DHFR-(His)590 40 50 50 DHFR-(His
