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1、1RP-HPLC 法测定马兜铃酸含量方法的优化作者：杜晓曦,周跃华, 路金才,韩娜,周娟, 毕开顺【摘要 】 目的 优化高效液相色谱法对马兜铃酸进行含量分析。方法 通过比较不同提取溶剂、不同提取方法,确定较为合理的供试品溶液制备方法。比较不同流动相条件对马兜铃酸含量测定的影响,选择含量分析色谱条件。测定不同波长下的最低检出限度,确定痕量分析条件。结果 供试品溶液制备中以 70%甲醇直接加热回流提取,效率优于其他提取方法。做一般含量分析时可以选择流动相为甲醇-1%醋酸水溶液(7030)或乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5) (2575),250 nm 或 319 nm 作为检测波长。
2、做痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)(2575),并选择检测波长为 224 nm,最小检出量可达 0.02 ng。结论 本实验所建立的方法可以准确可靠的进行马兜铃酸含量分析并进行痕量检查。 【关键词】 马兜铃酸；高效液相色谱法；含量测定Abstract：Objective To optimize the RP-HPLC procedure for the determination of aristolochic acid. Method Different extraction solvents and methods have been screene
3、d to get the most efficient way for sample preparation. The influence 2of different mobile systems on quantitation were compared to choose an approprate mobile system for determination. Besides, the minimum limits of different detecting waves were measured to give the method to detect trace amount o
4、f aristolochic acid. Result Refluxing with 70% methanol was better than other ways in sample preparation. Both methanol-1% acetic acid (7030) solution and 0.3% ammonium carbonate solution (pH=7.5)-acetonitrile (7525) with wavelength of 250 nm and 319 nm can be used for quantitation while 0.3% ammoni
5、um carbonate solution (pH=7.5)-acetonitrile (7525) with wavelength of 224 nm for trace detection. The minimum detectable amount was 0.02 ng. Conclusion The method established can be applied to determinate aristolochic acid and detect trace amout exactly.Key words：aristolochic acid；RP-HPLC procedure；
6、sample preparation；chromatographic condition马兜铃酸是马兜铃科植物中的主要成分,近年来已证实其具有肾脏毒性。鉴于马兜铃科植物种类很多,名称混淆现象也很常见,各地方用药种类十分复杂,所以, 有必要建立一个简单有效、便于推广的方法对马兜铃酸进行定量分析,以便真实准确地反映出药材或制剂中马3兜铃酸的含量,保证用药安全。目前, 高效液相色谱法是在马兜铃酸含量测定中使用最多、发展也较为成熟的一种方法,但测定条件多种多样。为此,本试验从供试品溶液的制备、色谱条件的选择两个方面进行了研究,以期建立并推荐一个能准确反映马兜铃酸含量的高效液相色谱法。1 仪器与试剂美国
7、科普公司 SSI PC3000 高效液相色谱仪 ,Model 500 紫外检测器,HORIBA B-212PH 计,Anastar 色谱工作站。色谱纯试剂购自天津康科德化学试剂厂,分析纯试剂购自山东禹王化学试剂厂。关木通(两年生 )采自沈阳药科大学药用植物园 ,马兜铃酸 A 对照品购自中国生物制品检定所(批号 110746-200204)。2 供试品溶液的制备 2.1 提取溶剂的选择现有的研究中, 马兜铃酸的提取溶剂多数选择甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸来提取,有文献报道, 丙酮-10%甲酸提取效率较高。我们也重点考察了该浓度酸及常用溶剂对提取效率的影响。取干燥关木通药材粉末(40 目 ),
8、精密称定 30 份, 各 0.5 g,分别加入表 1 所示4溶剂各 20 mL,每种溶剂各提取 2 份, 共 30 份, 分别浸泡 2 h,超声 15 min,过滤,滤液蒸干,残渣以甲醇溶解, 定容至 10 mL 容量瓶中,微孔滤膜过滤后,供 HPLC 测定用。结果见表 1。表 1 不同提取溶剂的比较（略）从实验数据看,甲醇、乙醇不适宜对马兜铃酸进行提取,加入酸或醇水溶液,可使马兜铃酸的提取效率显著增加,综合比较各种溶剂,70%甲醇对马兜铃酸的提取效率最高,可以作为马兜铃酸的最优提取溶剂。2.2 提取方法的选择索氏提取法：取 0.5 g 关木通药材粉末 4 份, 以 70%甲醇 120 mL
9、分别索氏提取 1、2、3.5、5 h,分别测定含量,结果表明 3.5 h 后峰面积不再增加。直接加热回流法：取关木通粉末 1 份,提取溶剂为 70%甲醇 25 mL,提取 1 h,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取 2 次, 分别得滤液并测定含量。结果表明 ,关木通提取 1 次即 1 h 即提取完全。超声提取法：取关木通粉末 1 份,提取溶剂为 70%甲醇25 mL,提取 15 min,过滤, 滤液进行含量测定,滤渣再重复提取 4 次,分别得滤液并测定含量,结果表明, 关木通重复提取 4 次即 1 h,即提取完全。见图 1。5从图 1 可以看出, 在提取完全的情况下 ,超声提取法需提取 4
10、 次,耗费 1 h,消耗溶剂共 100 mL；索氏提取法需提取 3.5 h,消耗溶剂 120 mL；直接加热回流法需提取 1 次,提取 1 h,消耗溶剂 25 mL,即可提取完全。故建议选择直接加热回流法提取。3 色谱条件3.1 流动相对马兜铃酸含量测定的影响从大量的文献报道来看,马兜铃酸含量测定的流动相一般使用甲醇-水系统1、乙腈-水系统2,另有采用乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5)3系统, 本试验对不同流动相系统 甲醇-水-冰醋酸(70301)、乙腈-水- 冰醋酸(50501)、乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5,2575)进行了比较, 见表 2。由表 2 可
11、以看出,3 种流动相条件均可与其他成分实现基本分离, 理论塔板数也符合定量分析的要求, 但在乙腈-水系统下,马兜铃酸计算含量偏低。表 2 不同流动相系统的比较（略）3.2 低酸度对色谱分离的影响由于马兜铃酸属于酸性物质,流动相中加入适量的酸可以改善峰形, 但是酸的加入将会影响色谱住的使用寿命,本节探讨不同酸度对马6兜铃酸分离的影响,结果见表 3。表 3 低酸度对色谱分离的影响（略）从表 3 可以看出, 甲醇-1%醋酸水溶液流动相条件分离度良好,理论塔板数符合定量分析要求,降低酸度不影响色谱分离,甲醇-1% 醋酸水溶液适合作为含量测定的流动相条件。3.3 痕量分析时色谱条件的选择仪器及方法的检测
12、限度是进行马兜铃酸痕量分析的重要指标,为确保用药的安全性,要求色谱条件具有较低的检测限。马兜铃酸有 4处最大吸收,即 224、250、319 、390 nm。取配置好的 0.05 mg/mL 马兜铃酸对照品溶液, 采用无限稀释法,流动相选择甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(PH=7.5),并配以不同检测波长进行最低检出限度的考察,结果见表 4。表 4 不同色谱条件的最低检测限度(略 )从表 4 可以看出, 乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)配以 224 nm 检测波长可以获得最低的检出限度( 见图 2),该条件可用于限度检出。此外 ,根据样品在不同波长下的最
13、低检测限可以看出,样品在 390 7nm 处检测限较高, 不适合作为马兜铃酸含量测定时的检测波长,而250 nm 及 319 nm 检测波长下检出限较低(1 ng),信号相对较高, 适合作为含量分析的检测波长。同时, 考虑到 224 nm 检测波长在复杂样品分析时易出现杂质峰干扰,不建议作为含测检测波长。4 小结与讨论本试验对高效液相色谱方法测定马兜铃酸含量的供试品溶液的制备方法进行了条件优化选择,确定供试品溶液的制备方法为 70%甲醇直接加热回流法进行提取。在流动相选择上, 研究发现,甲醇-1%醋酸水溶液(7030) 及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)可以满足马兜铃酸含量分析
14、需要,结果较为准确。当药材中马兜铃酸含量较低,需进行痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5),检测波长为 224 nm。本试验首次对甲醇- 水分离马兜铃酸的酸度进行了考察 ,发现采用低酸度的甲醇-1%醋酸水溶液对马兜铃酸进行含量测定, 不仅可以获得良好的分离效果,且可以减缓流动相对色谱柱的损耗,适宜用作马兜铃酸的含量测定方法。【参考文献】81 由丽双,王智民 ,姜 旭,等.HPLC 法测定不同产地关木通中马兜铃酸 A 的含量J.中国中药杂志,2003,28(5) ：465467.2 Chang YS, Deng JS, Ku YR. Determination
15、of aristolochic acid in traditional Chinese prescriptions, containing Radix Aristolochiae Fangchi by HPLCJ.J Liquid chromatography & related technologies,2002,25(6)：961 975.3 Lee T Yei, Wu ML, Deng JF, et al. High-Performance Liquid Chromatographic dertermination for aristolochic acid in some medicinal plants and slimming productsJ.J Chromatography B, 2002,766：169174.
