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1、迎丝垒垫鱼塑矍旦全三第3卷第2期辣粮过氧化物酶结合物的质且鉴定浙江医科大学传染病研究所蒋成淦吕新法张秀芝内容提要辣 根过氧化物酶(HR功和抗HB。(山羊I灼)按戌二醛二步法、苯醒法和改良过碘酸盐法交联反 应分别制成酶结合物,用凉脂扩散、二氨基联苯胺染色法对酶结合物定性,并测定其 HR P一浓度和活性、羊工毋 浓度和抗HB日免疫活性,阐明标记率(A4 03nm/人汾o nm)的含义,通 过E L I S人检测表明标记率可作为评价酶结合物质量的指标,且其计算简便。酶联免疫吸附剂测定法(EL ISA)具有特异性强、敏感性高、不需特殊设备且无放射性危害等优点,在生物医学领域 中得到了广泛应用。酶结合物
2、是E L工 SA中的关键试剂,用不同方法制得的酶结合物质量不同,目前尚缺乏统一的质量鉴定标称本文参照荧光素标记抗体质量鉴定1 ,s 1等方法,以检测乙 型肝次表面抚原(RB妞幻的EL Is A为模式系统,来评价酶结合物的质量。材 料和方 法一、HRP一抗Hs B结 合物 的制备:、辣根过氧化物酶(HR P)为西德Bo曲沙卜g erMa nh ni emGl nbH产品,R Z=3.0 8,用邻联简香胺法测得酶活性为熟58 4单位/毫克。抗HB。(山羊g IG:)用纯化的HBoAg免疫山羊制得抗血清,提取IgG部分后再用亲和层析 法除去抗人血 清 成份;提纯 后的抗HB。(山羊工gG)浓度为1.
3、0 5毫克/毫升,被动血凝法(pHA)效价为七 2 a8。理RP一抗且B。结合物的制备参照Av r, “等们的戊二醛二步法、Te rn yc nk等:.I 的苯醒法和W且“o n等月的改良过碘酸盐法的程序分别进行。交联反应产物经s e仙a d。“G一2 0。层析柱纯化。二、HRP一杭H价结合物钓质t鉴定(一)酶结合物的定性用琼脂免 疫 双扩散法,沉淀线用二氨基联苯胺染色闭。(二)HR P浓度和酶活性测定:按Wo rih tng to n酶学手册 j介绍的方法进行。.(三)酶结合物中羊烤G的浓度 用紫外分光光度法(UV )测定,杭HB。活性测定按1979年全国病毒性肝炎流行病学调查主要检测技术规
4、浑中的p以法进行。(四)H B认g检测用ELI SA双抗体夹心法8。结 果与讨 论一、交联反 应产物的纯化用三种不同的交联方 法 制得的HRP-抗H价结合物(简称酶结合物)经s e坤a deG一2 00柱层析纯化洗脱的图形见图1。戊二 醛法(图1一A)和苯酿法(图1一B)都有三个洗脱峰:前者第一峰和第二峰前半部的标记率(A4o 3nm/A28 0nm)接近0.4,第二峰峰尖部因混有未标记的I gG,标记率降为。.2左右,第三峰为游离HRP;后者各管的标记率都低于0.4,游离的HR P较多。改良过碘酸盐法产物的洗脱图形(图 卜0)呈现一个大峰,标记率在0.8以上,因大部HRP均交联在酶结合物中,
5、游离的HRP只呈现一个小的峰形。二、酶结合物的特性(一)在琼脂双扩散中,三种交联反应制得的酶结合物与且B白东g之间均形成沉淀线,并与羊抗且B“(I酮)和狂BoAg间形成: .。二. .一一一. 一一一一八,训引懊“十卜卜卜盆r.日.甲 . ,.且盆.咨自电.申- -几呻呀:白二考冗-二.,.卜从旅./.,一,二, 一 阿沁叹户、夕01 0203 04 0印加70管数图1交联反应产物过Sephad exG一2。柱层析纯化的洗脱图形:A.J戈二醛二步法交联反应B.苯醒 法交联反应C.改良过碘酸盐法交联反应A2 8onm A4o 3nm一标记率 (A4 O3nm/A28 0nm ) 物p hadox
6、G一2以,层析柱(即城翻电米 )用pH7.4、0.0 1皿P升0.14卫N名lC平衡和洗脱,流速2 0毫升/ 小时,1 2分钟收集一管,共收10 0管。用75 1型分光光 度计测各管的人40 3nm和A2 8onm的沉淀线融合,用二氨基联苯胺染色后,酶结合物与R现A g之间的沉淀钱呈棕褐色,表示该沉淀线中有H RP活性。酶结合物、羊抗HB。分别与兔抗羊190抗体形成的沉淀线也呈弧形融合,染色后酶结合物的沉淀线显色,羊抗HBs的沉淀线则否。表示酶结合物中的杭HBs(山羊I酮)确已与HRP结合,是同时具有抗HB。免疫活性和HR P 酶活性的标记抗休。(立)三种交联方法制得的酶结合物经氏h Pa d
7、x eG一2的纯化后,将主峰部分分别合并、浓缩(戊二醛法为第1 6 一3 2管,称G峨1,苯酿法为第妞 4 0瞥,称B一H,改 良过碘酸盐法为第1 2一 3 5管,称P),测定其HRP浓度、酶活性、羊奄仔浓度及抗HB。效价等(表1 )。三种方法制得的雄结合物中,且R P活性以G一1 1为最高,达结合前的8 7.6%,P和B一H均较差,分别为结 合前的5 9%和4 3.5%。酶结合物中抗H马“效价均比标记前明显降低,其 中以戊二醛法制得的酶结合物抗体效价卞降较少,可能与该法反应条件较温和有关。表1HR卜抗H Bs结合物的生物化学和免疫学活性HRP抗HB.(羊Igq)酶结合物*毫克/毫升*字毫克/
8、毫升单位/毫九活性*半 *SRI DB11G一11PO一D1680.0840.6615543 1402112).25).6 30.320.250,901。64210215210,齐1 1,G一1 1及P分别为苯酮法、戊二醛法、改良过碘酸盐法制备 的酶结合物经s ephade圣GZo o层析后的主峰部分抗HB可羊IgG)浓度分别用单向辐射免疫扩散法(SR ID)和紫外分光光度法(U V)测定。以UV测定结果为木文计算依据,计算公式另文发表。布 * *抗HB“的免座学活性以被动血瞬法(PH人)滴度的倒数表示(三)交联反应产物经决沙a de xG一20 0n叫AZ即确)、酪 /抗体克分子 比( E/
9、P),结柱层析纯化洗脱的各管酶几结 合物于却3 nm果见表2。标记率为丑只卫的正铁血红素辅和28 0nm测定光吸收值并计算标记率(A4 03基特异吸光度(A40 3”血)与抗体球蛋白和几酶93.蛋白中的色氨酸、酪氨酸等的吸光度(A28 ( )nm)之 比值,表示酶标抗体中HR P所占的比例。标记率和E/P值呈高度正相关(二 二_0.。s,夕二劝.2 175+2.1966劣),这与w滋-wi c k等,发现当酶结合物的A403几m/A28 0nm=0.4时,E/P之比约为1是相符的。标记率的计算较E/P的计算简便是其优点。三、酶结合物用千 艺Lls A定里检测HBsAg将三独方法制备的酶结合物分
10、别稀释到人相近的HRP或羊190浓度后 用于检测且B*-Ag的结果见 表3。G一叮稀 释2 5仓倍、P稀“释2,0 00倍时HRP的浓摩约33 0毫微克/毫升,都能检出1:6,40 1 0稀释的纯HBoAg;当G一11稀释1,00 0倍、P稀释2,000倍时,羊IgG浓度分别为90 0和82 0毫微克/毫升,两者亦接近,而标记率高的一尹检涎HB ,Ag的敏感性较G一1 1高8倍。若将酶结合物稀释到每毫 升中含有相等的只R P活性时,检测效果亦以P为最优。标记率最低的BJ工,无论以何种标准稀释,检测HBsAg的效果都最差,提示 标记率( A4O3 nm/A2 8。五 垃)可作为衡量宜R户结合物质
11、量优劣的指标。表2酶结合物的标记率(A40 3却n了A 28Onm)和酶 /抗体克分 子比(E/P)酶结合物一价标记率A4 O3几m/A28 0nmHR卫毫克/毫升羊抗H习:(I gG)毫克/毫升E/P甲 , , , , 州一一 , 州 一 一甲 , 户甲, 一, 曰护尸一一一,1一, 梦一宁一一一 一t甲 , 一叫,户响 一一一一 ,一一卫卜13Be s15卫卜1 7B-1 9B一210 210.190.210.260.410.D魂2 30.( )阶40.0邵4O,02230,0 1560.3 40.3 t0.3丢0.430.7 2G一13G一15G一王7G一19G毛10.330.38O。拐
12、0JS0.43口.0 03 60.目4 40.0 03多0.00240.0028、才、毛D。0 1D()D、饮方么0.砚均6 0o即760.(旧920。06460.03990.02830.0 2960.0 4 邵0,620.湘0.8尽1.0 20.86302片了67片 子即. 月上土.土,工P一13R15P一17P一1 9P一210.810.8 30.840。86Q。即0.06 2 40.3 1360.1 8X ( )0 9= 4 8职铭Q0,15350.740 00.4 1790.21400,1018表3ELI SA中用定俊的酶结合物检测HB眺g的结果酶结合物的特 性HBsAg稀释倍数(xl
13、o o)一一O 一一曰O 一一一一曲 , 工 O 一00一一O自一一一一一一一一 HR P毫撤克/毫升单位/毫升抗 HB导(羊IgG) 毫微克Z毫升1 1 16 6 6犯犯64 4 44 4 4 4 48 8 816 6 6犯犯稀释倍酶数结合物0.50.1石O( 01(X列)0 00 00 02 0肠68八廿85nnJl1.00.5Q一260.7O。60 06 0 昭加8 43 0邪3 31 132功咖脚溯0 0 00 0 08 0 0弃一1 1G一11P94参 考文献1,J .、J23尹r 、41北京医学院微 生牧肩全教研组;实验免疫学,.PO Z氏人民卫生出版社,198 0WalwiekE
14、Re七a 1:人位JCl inP叭hol,6 3:21 9,1盯万北京神经外科免疫组:中华医学检验杂志,卜牲,1盯8 Wort bing tonBioehemse肠2Corpora七 io n:Wor切ing七onEn叮meM么nual,B01、1 1、1、7,Fre eholdNJ,19726人vr amea日Se七肠1:Im mun倪hOn Iistry,8,1175,1盯16e TrnynckT“ai:ib i d,1曦:767,19777WiloonMB。七al:In;Iln 功只no王luores cen”eR七latedStainingTe ehni q助S,P215,E ls e
15、-vse r/North卫ozzandBiomod iealPr e s。,人m 眺er峨am,197容81蒋成淦等;浙江医学,(4):1,1邻2( 19 82年4月22日收稿,19 82年9月1 0日修回)EVALV入TIO NO FTHEQUAI LT丫O FHOs RERD AIs HPER OXID AS E(HRP)CONJU G ATESi J幼gh Ce ng. -gan(蒋成 涂) 时a l几s才艺云二eo f五1;介c艺。舫sD 落二ases,h Z。歹落a、9e Md落“ a乙玩坛公e犷s落云夕HRP ha “beeneonjuga tedtoantj一HB“(即就IgG)
16、thro ug hthet wo一就e Pg lu七“ r ald于五夕doeo upling,benzoqui加neeo叩ling,or哪difiedper五odateeo uplingmethods.T h。eh ar耽加rizi a to n可eo njugae tswe r ed e te rmind ebya邵rdif fu oionand3,3一diaminoben:idine咖iningpr o。裂.B朋id图,wehavede te e七edtheeo ncentrai tonanda etivi七 yofHRP,theeo ne叻tr ai to 刀of日hee PI gGanditsim mun o a etiv ityo 刀an七i一HBgandhaveexPlainedthe功e a ningf Qlabell主二gr咖( A4 o3nm/A 2
