石蜡切片免疫组化染色步骤

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1、石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES： 现用现配。 将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES中，停留 2030 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的 APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡

2、的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip液中， 停留 12 分钟， 然后用双蒸水快速清洗三次， 室温干燥或 60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶： 一般使用浓度为 0.05%0.1%， 消化时间为 37、 1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使

3、用浓度为 0.4%，消化时间为 37、30180 分钟， 主要用于细胞间质抗原的显示， 如： Laminin （层粘蛋白） ， Collagen IV（IV 型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin） ：一般使用浓度为 210g/ml 的 saponin溶液，消化时间为室温孵育 30 分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如 TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以 0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包

4、溶于 1000ml 的蒸馏水中，混匀，其 pH 值在 6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的 pH 值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3H2O2处理 10 分钟，蒸馏水洗 2 分钟3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液） 的容器中， 置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 9298之间并持续 1015 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件， 务必满足以上步骤中对温度和时间的要求） 。取出容器，室温冷却 1020 分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型） 。PBS 洗，下接免疫组化染色步骤

5、。 3.2 石 蜡 切 片 高 压 抗 原 修 复 操 作 方 法 ： 切 片 脱 蜡 至 水 。 将1500ml3000ml 的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热 56 分钟后） ，计时 12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS 洗 2 分钟3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小

6、容器的温度到达 9298起开始计时 1520 分钟，然后端离电炉，室温冷却 2030 分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国 ZYMED 公司 SP 试剂盒为例） 4.1 石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2 室温孵育 510 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 4.4 510正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育 12小时或 4过夜。 4.5 PBS 冲洗，5 分钟3 次。 4.

7、6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释） ，37孵育 1030 分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育 1030 分钟。 4.7 PBS 冲洗，5 分钟3 次。 4.8 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释） ，37孵育 1030 分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育 1030 分钟。 4.9 PBS 冲洗，5 分钟3 次。 4.10 显色剂显色（DAB 或 AEC） 。 4.11 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 48mm， 室温放置 30 分钟后， 入 4丙酮固定 10 分钟， PB

8、S洗，5 分钟3。用 3过氧化氢孵育 510 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟2。 下接免疫组化染色操作步骤。 细胞免疫化学：免疫酶标技术 1） 直接法 1标本固定。 2PBS 洗涤 23 分钟。 31 H2O2（或 1 H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 1020 分钟。 4正常血清（1：10）孵育，室温 20 分钟。 5滴加酶标记的抗体 371 小时或 4过夜。 6PBS 洗涤 33 分钟。 7DABH2O2 显色 510 分钟，镜下控制染色结果。DABH2O2应用前 15 分钟配制。 8充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。 2） 间接法 1标本固定。 2

9、PBS 洗涤 23 分钟。 31H2O2（或 1H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 1020分钟。 4正常血清（1：10）孵育，室温 20 分钟。 5滴加第一抗体，371 小时或 4过夜。 6PBS 洗涤 33 分钟。 7滴加酶标二抗，室温 1 小时。 8PBS 洗涤 33 分钟。 90.04DAB0.03 H2O2 显色 510 分钟。 10 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。 3） PAP 法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法） 1标定固定后，PBS 洗涤。 21H2O2（或 1H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温 1020分钟。 3PBS 洗涤 23 分钟。 4正常血

10、清（二抗的正常血清）孵育，室温 20 分钟。 5滴加一抗，室温 1 小时或 4过夜。 6PBS 洗涤 33 分钟。 7滴加二抗，室温 30 分钟。 8PBS 洗涤 33 分钟。 9加 PAP 复合物，室温 60 分钟。 10 PBS 洗涤 33 分钟。 11 0.04DAB0.03 H2O2 显色 510 分钟。 12 充分水洗。 13 苏木精复染，封片观察。 4） 双 PAP 法 110 同单 PAP 法。 11 二次加酶标二抗。 12 PBS 洗。 13 二次加 PAP。 14 PBS 洗。 15 0.04DAB0.03 H2O2 显色 510 分钟。 16 苏木精复染核，封片，镜检。 5

11、） ABC 法（卵白素生物素过氧化物酶复合物法） 18 同 PAP 法 9）加 ABC 液，室温 60 分钟。 10） PBS 洗。 11） 0.04DAB0.03 H2O2 显色 510 分钟。 12） 充分水洗。 13） 苏木精复染核，封片，镜检。 免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂， 其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssma

12、n 氏抗原） ，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠） ，其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉 50100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动 2

13、h，4中过夜，再搅拌 10min，高速离心 （300015000r/min）30min，12 次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸收前后之比较， 吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿， 离心 （300015000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法， 对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据 Hiramotos 氏等的方法将组织的 20%

14、生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 23 次，12000r/min 10min 离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。 【肝粉的制法】 （1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗 23 次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。 （2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。 （3）将肝匀浆装入离心管内（1/3 左右） ，交换地用 23 倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/m

15、in 离心沉淀 15min 后，再除去上清液。 （4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37烤干（过夜） 。 （5）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。 （二）透析法 荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。 （1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。 （2）浸入 0.02mol/ph 7.17.4 的 PBS 中（悬于大于标记物体积约 50100 倍的 PBS 内） ，在 4中透析，每日更换 34 次 PBS，约57 天，

16、透析液中无荧即可（在荧光光源照射下） 。 （三）葡聚糖凝胶 G-50 柱层析法 除游离荧光素可用 246cm 柱层析法，详细方法参阅第二章 。加入荧光抗体 1518ml（按床体积的 5%10%加样） ，使其缓慢渗入柱内， 待即将全部入柱时， 加入PBS少许， 关闭下口， 停留3040min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层