血型鉴定及血细胞标本制备与观察

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1、血型鉴定及血细胞标本制备与观察血型鉴定及血细胞标本制备与观察 上课地点：化学楼上课地点：化学楼 120 任课教师：陈丽杰任课教师：陈丽杰 办公地点：生化楼办公地点：生化楼 215 电话：电话：84706308 课程要求：课程要求： 预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤； 完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤） 实验注意事项：实验注意事项： 1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐； 2、实验废物按实验室管理老师要求收集； 3、实验结束后，经老师检查后方可离开。 实验纪律：实验纪律： 1、按时上课 2、穿实验服（白大衣） 3、不许吃东西

2、，课堂严禁大声喧哗 4、手机静音 实验成绩：实验成绩： 预习报告： 20 分 实验操作： 40 分 报告内容：结果和讨论 40 分 血型鉴定及血细胞标本制备与观察血型鉴定及血细胞标本制备与观察 （指导教师：陈丽杰） 一、实验目的：一、实验目的： 掌握人体血型（ABO 型）的鉴定方法和原理，观察红细胞凝集现象，同时了解自己的血型； 掌握血涂片的制备方法；认识红细胞及各种白细胞的典型形态； 学习巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理：二、实验原理： 红细胞膜上具有血型糖蛋白，作为抗原，也称为凝集原；ABO 血型就是根据红细胞表面抗原来确定的，根据红细胞上有或无 A 抗原或/和 B 抗原，将血型分为

3、A 型、B 型、AB 型及 O 型四种。 血清中含有相应的特异性抗体称为凝集素。 凝集原和相应的凝集素特异性结合，使红细胞凝集成团，进而引起红细胞破裂，产生溶血。 ABO 血型鉴定的原理是利用红细胞凝集试验，将待测血液分别与已知含 A抗体和 B 抗体的标准血清混合，观察是否发生凝集现象，判断待测血液红细胞上有何种抗原，由此确定待测血液的血型。 三、实验器材与试剂三、实验器材与试剂 （1）仪器与材料： 普通光学显微镜，采血笔，刺血针、载玻片，盖玻片，滤纸，擦镜纸，无菌棉签，消毒牙签，培养皿等； 受检者血液； 生物标本永久制片。 （2）试剂和药品： 瑞氏-姬姆萨 A 液（主要成份：瑞氏染料，姬姆萨

4、染料） ； 瑞氏-姬姆萨 B 液（主要成份：磷酸盐） ； 抗 A 血型定型试剂，抗 B 血型定型试剂; 碘伏 香柏油，乙醚，乙醇 四、实验步骤与操作方法四、实验步骤与操作方法 （1）ABO 血型鉴定 取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，左上角写 A 字，右上角写 B 字。 用无菌棉签蘸上碘伏，消毒无名指指端后，以消毒针刺破皮肤取血，载玻片的每侧各放入一小滴血（指端采血点勿触及载玻片！ ） 。 用小滴管吸抗 A 血型定型试剂一滴加入左侧， 用另一小滴管吸抗 B 血型定型试剂一滴加入右侧，并用牙签搅拌，使标准血清与血液混匀。 （每边用一支牙签，切勿混用！ ） 。 室温下静置 1015min，观察有

5、无凝集现象。假如只是 A 侧发生凝集，则血型为 A 型；若只是 B 侧发生凝集，则血型为 B 型；若两边均未凝集，则为 O 型；若两边均发生凝集，则为 AB 型。 用碘伏消毒左手无名指指腹 采血笔按住已消毒的指腹 采血 血滴分别滴在载玻片的两端(皮肤不可接触玻片) （2） 血涂片的制作 挤出第三滴血置于一干净载玻片的右侧（注意勿触及皮肤，否则血在玻片上就不能成滴）。 以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住另一干净载玻片，用其窄边接触样品（血滴），使其在两载玻片接触处展成线状。以约 45角轻推载玻片，使样品展成一薄层血膜（图 1）。注意推片动作要连贯，血片的厚度依血滴大小、推片速度和两片夹角而定。血

6、滴小，速度慢，夹角小则血片薄。 图 1 血涂片制作示意图 待血片晾干后，滴加瑞氏-姬姆萨 A 液 1 滴于涂片上，并让染液覆盖整个标本涂片染色 1min，再将 23 滴瑞氏-姬姆萨 B 液滴加于 A 液上面，以嘴吹出微风使液面产生涟漪，使两液充分混合，染色 310 min。 水洗（冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上），自然晾干，镜检。 （3）血细胞的观察 红细胞：数量最多，体积小而圆、均匀分布，呈红色的圆盘状，边缘厚，着色较深，中央薄，着色较浅，无细胞核、细胞器，胞质内充满血红蛋白； 白细胞：数量较红细胞数量少，但胞体大，细胞核明显，极易与红细胞区别开。 嗜中性粒细胞嗜

7、中性粒细胞 是白细胞中较多的一种，约占白细胞总数 50-70%。体积比红细胞大，主要的特征是胞质中的特殊颗粒细小，分布均匀，着淡紫红色。胞核着深紫红色，一般分 35 叶，叶间以染色质丝相连。核分叶的多少与该细胞年龄有关，如核为杆状，则为嗜中性粒细胞的幼稚型。 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞 比中性粒细胞略大，数量少，约占 7%以下。核常分两叶，着紫蓝色。主要特点是胞质内充满粗大、圆形的颗粒，色鲜红或桔红。 嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞 数量很少，约占 1%以下。在一般血涂片上不易找到，体积比上述 2 种白细胞稍小。胞质中分散着许多大小不一的深紫蓝色颗粒。胞核形状不定,圆形或分叶，也染成紫色，但染色略浅，

8、一般都被颗粒遮盖，形状不清。 淋巴细胞淋巴细胞 数量较多，约占 20%-40%，可见中、小型，淋巴细胞。其中小淋巴细胞最多,略大于红细胞。核大而圆,几乎占据整个细胞，染成深蓝紫色。胞质极少，仅在核的一侧出现一线状天蓝色或淡蓝色的胞质。中淋巴细胞比红细胞大，胞质较小淋巴细胞的稍多，着色较浅。核圆形或卵圆形，位于细胞中部，也染成深蓝紫色。 单核细胞单核细胞 数量少，约占 2%-8%，是细胞中体积最大的一种，胞核呈肾形、马蹄形，常在细胞一侧，着色比淋巴细胞浅。 图 2 血细胞形态图 五、作业与思考：五、作业与思考： 1. 受试者的 ABO 血型属于哪一型？试述判断依据。 2. 实验体会 实验要求：实

9、验要求： 记录结果。 血型检测结果 描述用你制备的血涂片在显微镜下观察到的各种血细胞（若有可能，可以拍照，可以自备相机） 实验注意事项实验注意事项 （1）采血前用碘伏棉签消毒受试者的无名指指腹，采血后用碘伏棉签按压受试者的无名指指腹 （2）严禁使用他人用过的采血针 （3）采血的手指不可接触试剂，尤其是抗 A 血型定型试剂，抗 B 血型定型试剂 （4）需要更换标本时，将物镜转离载物台，方可取下或放置标本片 （5）课前预习试验，并写预习报告 （6）实验报告必须用学校专用实验报告纸、按规范格式编写（参考附件 2、附件 3） 附件附件 1：实验背景资料：实验背景资料 1 光学显微镜的原理、构造及使用方

10、法光学显微镜的原理、构造及使用方法 1.1 光学显微镜的基本构造 1.1 光学显微镜的基本构造 图 1 显微镜的基本结构图 光学显微镜的基本结构包括机械、照明和光学三部分（图 1，表 1） 。显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立的实像，再经目镜的进一步放大形成一个虚像，被人的眼睛所观察到。每台显微镜一般有 34 个物镜，可分为低倍镜（如 4，10） ，高倍镜（如 40）和油镜（100） 。目镜通常有 5、10和 15三种。目镜只起着放大作用，而物镜决定显微镜的分辨率。物镜外壳上通常标有放大倍数、数值孔径、镜筒长、盖玻片的厚度和使用条件等性质参

11、数。如标有“oil，N.A.1.30，100，160/0.17”的物镜表示数值孔径为 1.3， 放大倍数为 100 倍的油镜。 其要求镜筒长为 160 mm，盖玻片的厚度为 0.17 mm。数值孔径（Numerical Aperture）是决定显微镜分辨率的最重要参数。 表 1 显微镜的基本结构 显微镜部分 具体部件名称 机械部分 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器，载物台、调节器 照明部分 光源、聚光器 光学部分 物镜、目镜 1.2 显微镜的分辨率1.2 显微镜的分辨率 （1）瑞利极限（Rayleigh limit） ：光学显微镜的最大分辨率为 0.2 m。根据瑞利极限计算显微镜的分辨率如下式：

12、d=0.61/N.A.(N.A.=nsin) 式中，d 为分辨距离，单位m；为照明光线的波长；N.A.为数值孔径；n为介质的折射率；为物镜镜口角的一半的角（镜口角是通过样品的光线延伸到物镜光孔边缘所成的角） 。 从式中可见，可通过缩短使用光波长或增加数值孔径来提高分辨率。电子显微镜的光源是比可见光波长短 10 万倍的电子束，所以其分辨率可达 0.20.3 nm。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察，所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的。从公式中可知：提高数值孔径有两种方法，一是增大镜口角，二是增大物镜与标本之间的折射率。采取前一种方法时，可以让标

13、本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，镜口角总是小于 180，sin总小于。采取后一种方法时，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。当空气为介质时折射率为 1，而香柏油的折射率为 1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。因此，油镜的数值孔径较大，分辨率较高。 （2）显微镜的放大率：显微镜的总放大率一般为物镜与目镜放大倍数的乘积。总放大倍数要和数值孔径匹配， 应在 500-1000 N.A.值之间， 此为有效放大范围。 （3）照明系统对分辨率的影响：聚光器是照明系统中的重要部件，调节不当不但可影响照明的均匀性， 还会降低显

14、微镜的分辨率， 直接影响图像的反差。 因此，在使用显微镜观察标本前，首先需要调节照明系统，主要通过聚光器的调节控制光线照明物体的光锥角度，以得到最佳的分辨率和反差。 1.3 显微镜的使用方法 1.3 显微镜的使用方法 （1）调节照明系统：通过调节光亮调节器、聚光镜的上下位置及虹彩光圈(孔径光阑)使视野内的光线均匀，亮度适中。因其最佳调节很大程度上取决于标本固有的反差特征，所以在观察标本时还要随时调整照明系统，以达到最佳效果。当照明光束与显微镜的光轴不在同一轴线上时， 还需通过调节聚光镜中心调节旋钮进行合轴调节 （centering adjustment） 。 调好后， 不要再随意调节中心调节旋

15、钮。 （2）低倍镜观察：将标本片固定在载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。旋转转换器，将低倍物镜调至光路中央。旋转粗调节旋钮将载物台升起，从侧面注视小心调节物镜接近标本片约 5 mm 处，然后用目镜观察，慢慢降载物台，直至视野中出现清晰的图像为止。 （3）高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，轻轻转动物镜转换器，将高倍镜移至工作位置。调节照明系统后微调细调节旋钮使物像清晰。 （4）油浸镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域，先用粗调节旋钮下降载物台，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加一滴香柏油，从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台小心地上升，使油浸镜浸在香柏油并几乎与标本片相接触。将聚光镜升至最高位置并开足光圈，慢慢地降载物台至视野中出现清晰图像为止。 （5）使用后的整理：下降载物台，取下载玻片，转动转换器使物镜与通光孔错开。下降聚光镜，以免物镜和聚光镜发生碰撞危险。关闭光圈，关闭开关，拔掉插头。有些显微镜有内置蓄电池，故即使拔掉插头也一定要关闭开关。 （6）使用中的注意事项 养成良好习惯。比如要双目观察；转换物镜时要轻轻转动转换器，不要扳着物镜转动等等。 制作目镜上的指示针。在演示或考查学生观察效果时，最好用带有指示针的目镜。简易的做法是：轻轻拆开目