《高通量药物筛选利器——htrf,在抗体药物开发(bioprocess)中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高通量药物筛选利器——htrf,在抗体药物开发(bioprocess)中的应用（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 1 HTRF 技术介绍 快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得 Cisbio 的的 HTRF 技术一直是药物研发领域的领先技术之一技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于免疫检测，并广泛用于免疫检测。该技术已经在知名医药公司、。该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了生物技术公司和学术研究机构应用了 15 年以上。年以上。 HTRF（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯 液相体系中待测物的一种常用方法。该
2、技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer） 和时间分辨荧光 （TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两种技 术。这种结合将 TRF 的低背景特点和 FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活，具有很高的灵敏度和通量，实验数 据稳定可靠，假阳性率较低。虽然 HTRF 也是基于 TR-FRET 的化学技术，但它的许多特点把它与其它 TR-FRET 产品区分 开来。这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽） ，从而具有非 常长的半衰期，很大的 Strokes sh
3、ift（如右图所示，Eu3+ Strokes shift 300 nm） ；同时，镧系元素与络合的穴相结合， 这种结合的穴状物与其它所有 TR-FRET 产品使用的螯合物相 比，显著增加了稳定性（可耐受低 pH 值、金属离子、DMSO、 EDTA 等） ；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。 FRET 技术简介技术简介 FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能 量）受体。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光） ，如果它与受体在足够近的距离之内，可以 将能量共振转移到受体上。受体受到激发，发出特定波长的发射光。 将供体和受体分别与相互作用的两个生
4、物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到 足够近的距离，产生能量转移。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将 未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实 验时间和花费。 一般地，在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短，其背景荧光较 强。背景荧光主要来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的荧光 强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧 光非常短暂（寿命为纳秒级） ，可以利用时间分辨荧光方法将其去除。 2 TRF 技术简介技术简介 如前所述
5、，在生物溶液或血清中的很多化 合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速 荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使 用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式 （在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟） 可将快速荧光的干扰降到最低。 时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧 系元素的独特性质。在 TRF 中常用的镧系元素 是钐（Sm） 、铕（Eu） 、铽（Tb）和镝（Dy） 。与传统荧光基团相比，它们具有大的 Stokes shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒） ，这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。 通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系元素
6、必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到镧系元素上。 稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子 上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。 为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较 高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受 荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团， 当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。 3 专利号：US Pat
7、ent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，Prof. J.M. Lehns 在 1987 年获得了诺贝尔HTRF 技术的能量供体（技术的能量供体（Donor）和能量受体（）和能量受体（Acceptor） HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu3+ cryptate）或 Lumi4铽穴状化合物（Tb2+ cryptate） ，后者是近年与 Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受 体（Acceptor）均可为 XL665 和 d2。XL665 和 d2 激发波长 为 620nm，发射波长为 665nm，位于红外光区，进一步降低 了生物溶液对实验的影响（生物学成分
8、很少在红外光区有自 发荧光） 。对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是 Fluorescin、GFP 等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。XL665 是改良过的别藻蓝蛋白（APC） ，将 APC 的 亚基偶联，增加了稳定性。d2 是第二代受体，光谱学特征与 XL665 相同，但是分子量较小，约为 1KD，可减少空间位阻 对实验的影响。 当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激 发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为 620nm； 另一部分能量转移到 XL665 或 d2，发射波长为 665nm。 665nm 的发射光仅仅由 donor 引起的 FRET 产生。所以，当
9、生物分子相互作用时，有两个激发光 620nm 和 665nm；当不 存在相互作用时，只有 620nm 一个激发光（见右图） 。 穴状化合物与螯合物穴状化合物与螯合物 穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼能收 集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于跟镧 系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。 穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（Mg2+ 和 Mn2+等） 、螯合物（EDTA） 、溶剂或者温度。从 HTRF 能应 用到临床诊断（TRACE技术和 Kryptor工作站技术）就能看 出它也适用于浓度高的血清（50%） 。在读板前或者孵育时加
10、入 氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。 穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，所以可以进行动力学检测。 4 HTRF 技术的优势技术的优势 背景低，化合物和培养基的干扰小 均相检测（不需要洗板） ，操作简单 实验稳定，对酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA 比较耐受，并且读数稳定 24 小时 以上，甚至可达 7 天 应用灵活多样 易于实现微型化 HTRF 的应用的应用 HTRF 技术被广泛应用于细胞实验和生化实验，并应用于药物研发的不同阶段，从实验方法的建 立、高通量筛选（HTS） ，lead 到 hit，到临床前研究。这是一种很灵敏且稳定的技术
11、，可以使用 384 和 1536 孔板。自从 10 年前 HTRF 技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很 多基于抗体的研究，包括 GPCR（受体配体结合，受体二聚化，cAMP 和 IP-1 的检测，以及磷酸 化 ERK 的定量） 、激酶、细胞因子和生物标志物、生物过程（抗体和蛋白生产）等，以及蛋白和 蛋白、蛋白和多肽、蛋白和 DNA/RNA 相互作用的实验。HTRF 具有与 ELISA 同等的检测范围和 检测极限，但是它不需要洗板，可以极大地减少实验时间，所以 HTRF 技术可以取代大部分 ELISA 实验，为均相 ELISA。 5 HTRF 生物过程和抗体药物研发解决方案 前言
12、前言 随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子 生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。 当前，治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点。治疗性抗体也称为抗体药物，指能 在体内发挥疾病治疗作用的抗体制剂。 200 年前，人们将自白喉杆菌培养上清液中分离到的可溶性毒素注入马体内，发现得到的抗血清 可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。20 世纪 70 年代德国学者 Geroge Khler 和 英国学者 Cesar Milstein 利用细胞融合技术成功地制备了杂交瘤单克隆抗体 (mAb)以来，
13、抗体的 生产技术才实现革命性的突破, 其在诊断、治疗、预防和蛋白提纯方面显示了重要的作用和非常 广阔的应用前景。进入 80 年代，随着免疫学和分子生物学技术的发展，以及抗体基因结构的阐 明，DNA 重组技术开始被用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造， 以消除抗体应用的不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备出各种形式的重组 抗体，标志着基因工程抗体时代的来临。自第一个基因工程抗体人-鼠嵌合抗体于 1984 年诞 生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括嵌合抗体，人源化抗体、小分子抗体（Fab 片段、单 链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体等）及抗体融
14、合蛋白（免疫毒素、同位素等） 等不断完善，目前全人抗体生产技术也已处于蓬勃发展中。 最近的统计显示，在基于生物技术背景而进行临床实验的药物研究中，单克隆抗体药物占据了 18%，治疗性单克隆抗体已发展成为非常具有市场应用价值的产品。2009 年 FDA 批准的 14 个药 物中有 4 个为全人抗体，而这 4 个抗体药物中有两个抗体来自强生公司，使强生公司称为 2009 年抗体药物的最大赢家。目前，美国已批准 26 个单抗药物用于治疗，主要包括癌症，慢性炎症， 移植，感染疾病和心血管疾病。同时，伴随着基因组药物科学的发展，各类疾病的靶分子被越来 越多的揭示，迫切地需要针对对各类疾病相关的靶分子的抗
15、体药物。 抗体药物的筛选过程和作用机理抗体药物的筛选过程和作用机理 在治疗性抗体的研发和筛选过程中，通常需要经过以下步骤：首先基于生物化学结合反应，利用 HTRF 或 ELISA 技术从几千至上万的样本库中筛选目标候选样本。在确定候选样本可以与表面受 体结合后，进一步从细胞水平确定候选样本与细胞的结合能力。随后，确定候选样本的 Kd， Kon/off 和 IC50 值，对抗体药物的亲和力等特性进行确定，最后一步是进行抗体药物的功能试验， 如抗体药物激活细胞表面受体后，cAMP 和 IP-One 的表达水平等等。 抗体药物进入人体内，通常主要通过五大作用机理发挥其功能效应：1)治疗性抗体可以和激
16、活受 体的配体结合，配体不再与受体结合，信号通路中断；2)治疗性抗体可以直接与目标受体结合， 从而阻断配体受体的相互作用，并下调细胞表面目标受体的表达；3)通过抗体的分子的 Fc 段发挥 功能效应，包括抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞溶解作用(CDC)；4)治疗性抗体6 与细胞表面受体结合后，激活下游信号分子，包括影响细胞增殖、分化、细胞因子分泌的信号分 子进一步调节细胞的功能；5）治疗性抗体与药物分子偶联，通过内吞作用进入细胞后，在溶酶 体的作用下，释放药物分子发挥功能。 图 1：治疗性抗体的作用机理(1-4 来源于 Andrew C. Chan,Paul J. Carter. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 10, 301-316. 5 来源于 David Schrama, Ralph A. Reisfeld,Jrgen C. Becker. Antibody targ
