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1、城乡对口支援临床检验技术标准制定及培训Program of Urban and Rural Counterpart Support on Clinical Laboratory Technology Standard Development and TrainingELISA检测检测技术要点与常见问题技术要点与常见问题关明 复旦大学附属华山医院 检验科内内容容 概念概念 实际工作中常见问题实际工作中常见问题 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme(enzyme- -linked linked immunosorbent assay immunosorbent assay ，ELISA)
2、ELISA) 反应原理反应原理 试剂盒组成试剂盒组成 操作中注意事项操作中注意事项 室内质量控制室内质量控制 完善完善ELISAELISA检测的质量保证体系检测的质量保证体系 常见问题原因分析及解决常见问题原因分析及解决 金标法金标法 反应原理、优点和缺点反应原理、优点和缺点 导致假阴性和假阳性的影响因素导致假阴性和假阳性的影响因素 建立质量保证体系建立质量保证体系ELISA的原理的原理 ELISAELISA属于标记免疫学技术的一种，属于标记免疫学技术的一种，19711971年由荷年由荷 兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以 定量，从而使其在免疫
3、学检测中得到了广泛的应定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应 用。用。 ELISA ELISA 关键：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体关键：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体 的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化 成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，由此进行定性或定量分析。直接相关，由此进行定性或定量分析。常见问题常见问题ELISAELISA技术掌握不好技术掌握不好-较大的技术难题较大的技术难题 白白板板 花花板板 灰灰区区 假假 阴阴 性性 假假 阳阳 性性白白板板花花板板均均板板重复性
4、重复性灰灰区区竞争法竞争法假阴性假阴性ELISAELISA检验方法相关项目检验方法相关项目乙肝抗体乙肝抗体 丙肝抗体丙肝抗体 梅毒抗体梅毒抗体 肿瘤标志物肿瘤标志物 性激素性激素 甲状腺激素甲状腺激素 ToRCHToRCH -ELISAELISA检验方法的原理检验方法的原理ELISA ELISA 常见类型常见类型1.1.双抗体夹心法（用于测抗原）双抗体夹心法（用于测抗原）HBsAgHBsAg2.2.间接法（用于测抗体）间接法（用于测抗体） HBsAbHBsAb3.3.竞争法（用于测小分子抗原竞争法（用于测小分子抗原/ /半抗原和抗体）半抗原和抗体）HBeAbHBeAb4.4.捕获法（用于测血清
5、中某抗体的亚型）特异捕获法（用于测血清中某抗体的亚型）特异IgGIgG一般情况下的双抗一般情况下的双抗 体夹心法体夹心法ELISA反应反应抗原过量时抗原过量时 一步法一步法ELISA反应会反应会 出现钩状效应出现钩状效应钩状效应（钩状效应（hook effecthook effect）钩状效应钩状效应 强阳性强阳性-假阴性假阴性方法：稀释后再测方法：稀释后再测特点：不易发现特点：不易发现避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通抗原的纯度对间接抗原的纯度对间接 法测抗体的影响法测抗体的影响正常血清中所含的高正常血清中所含的高 浓度的非特异性抗体浓度的非特异性抗体 对间
6、接法的影响对间接法的影响间接法的影响因素间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响假阳性假阳性鉴别鉴别结果回顾、诊断提示、临床沟通结果回顾、诊断提示、临床沟通复检复检必要时另一试剂盒复检必要时另一试剂盒复检抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化（1 1）已包被抗原或抗体的）已包被抗原或抗体的固相载体固相载体（免疫吸附剂）（免疫吸附剂）（2 2）酶）酶标记标记的抗原或抗体（结合物）的抗原或抗体（结合物）（3 3）酶的）酶的底物底物（4 4
7、）阴性）阴性对照对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）品和控制血清（定量测定中）（5 5）结合物及标本结合物及标本的稀释液的稀释液（6 6）洗涤洗涤液液（7 7）酶反应）酶反应终止终止液液ELISAELISA试剂盒组分：试剂盒组分：酶联试剂 阳性对照 酶标记物 显色液 A 终止液 反应板 显色液 B 浓缩洗涤液 加样枪与吸头 阴性对照 最常用的是聚苯乙烯、聚氯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或 蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但 空白值也略高。固相载体固相载体包
8、包被被将抗原或抗体固定的过程称为包被将抗原或抗体固定的过程称为包被(coating)。包被方式 ：间接包被（捕获包被）、亲和素生 物素包被、脂类物质自然干固包被 包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗 原三大类。 包被用抗体： IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联 结发生在Fc段上，抗体结合点暴露 于外。封封闭闭 封闭(blocking) 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。结合物结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中
9、关键的试剂1. 酶的催化活性2. 抗体（或抗原）的免疫活性3. 不含有或少含有游离的抗体（或抗原）4. 结合物要有良好的稳定性酶酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。酶及底物酶及底物酶酶底底 物物显色反应显色反应测定波测定波 长长辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶邻苯二胺邻苯二胺 四甲替联苯胺四甲替联苯胺 氨基水杨酸氨基水杨酸 邻联苯甲胺邻联苯甲胺 2,22,2- -连胺基连胺基- -2(32(3- -乙基乙基- -并并噻唑啉磺酸噻唑啉磺酸- -6)6)铵盐
10、铵盐橘红色橘红色 黄色黄色 棕色棕色 兰色兰色 蓝绿色蓝绿色492492 460460 449449 425425 642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶4 4- -硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP) 萘酚萘酚- -ASAS- -MxMx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐黄色黄色 红色红色400400 500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰黄色黄色 深蓝色深蓝色405405 420 420 - -半乳糖苷半乳糖苷酶酶甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG) 硝基酚半乳
11、糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色360,450360,450420420酶结合物的制备酶结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联 法和过碘酸盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使 酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%- 70%）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与 酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将 HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的 氨基形成chiff氏碱而结合。简便有效.酶的底物酶的底物邻苯二胺(OPD)、四
12、甲基联苯胺(TMB)或对硝基苯磷酸酯OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处 有最高吸收峰，。TMB经HRP作用后产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm。对硝基苯磷酸酯产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。洗涤液洗涤液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。对硝基苯磷酸酯作为底物用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。酶反应终止液酶反应终止液对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含
13、蛋白保护剂的缓冲液为基质。 阴性对照品阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。参考标准品参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。ELISAELISA操作中的注意事项操作中的注意事项 标本采集、保存 试剂准备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判断 溶血标本及混有红细胞的血清易产生假阳性,因溶血血清 中含有过氧化酶,造成假阳性 受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,造 成假阳性 在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致 本底过深,造成假阳性 EDTA、酶
14、抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化 物酶活性,造成假阴性 标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳 性结果 标本中有内源性干扰物, 不同程度影响检测结果。常见 的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其 他物质等标本采集、保存试剂的准备试剂的准备 选择高质量的试剂是保证结果准确的关键选择高质量的试剂是保证结果准确的关键室温平衡室温平衡所用蒸馏水或去离子水应保证质量所用蒸馏水或去离子水应保证质量试剂准备试剂准备加加样样 应将所加物加在ELISA板孔的底部。 每次加标本应更换吸头。 震荡充分混匀。 从滴瓶中滴加试剂，要注意滴加角度和滴加速度。 避免标本“交叉污染”
15、问题。加样加样温育常采用的温度有43、37、室温和 4（冰箱温度）。 37是实验室中常用的保温温度，也是大 多数抗原抗体结合的合适温度。 温育时间足够。 保温的方式一般采用水浴或电热块。 温育的温度和时间应按规定力求准确。保保温温洗洗 板板 分离游离的和结合的酶标记物 洗板的方式：自动洗板仪；手工操作有浸泡式和流水冲洗式 倾倒液体的方式 甩干孔内液体：应注意交叉污染和个人防护 吸干孔内液体：吸干应彻底，可用水泵或真空 泵抽吸（推荐） 如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含 非离子型洗涤剂的中性缓冲液。 聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离 子
16、型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏 水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而 削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基 团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液 状态，从而脱离固相载体。 洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓 度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被 在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏 度。显色显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。OPD底物显色一般在37反应20-30分钟。TMB约40分钟显色达顶峰。比比色色加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀。正确选择波长和参比波长。酶标仪使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更
