葡萄的组织培养快繁技术葡萄的组织培养快繁技术 甘肃农业大学生命科学技术学院（730070） E-mail： 摘摘 要要：植物组织培养，是根据植物具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细 胞，如根、茎、叶 、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁 组织、 维管束组织等， 在无菌合适的人工培养基及光照、 温度等条件下， 能诱导出愈伤组织、 不定芽、 不定根， 最后形成完整的植株 目前， 我国果树无病毒苗木迅速向产业化方向发展， 葡萄组培也成为实际应用最多、最有成效和最成熟的一项生物技术 关键字关键字：愈伤组织，原生质体，脱毒苗，培养基 1. 葡萄脱毒组培快繁技术的研究与应用葡萄脱毒组培快繁技术的研究与应用 1.1 葡萄试管快繁研究简史葡萄试管快繁研究简史 1944 年，morel 就开始了葡萄愈伤组织的培养1955 年 Fallot、1959 年 Pelet 等培养葡萄的茎生成不定根1961 年 Galzy 成功的培养了葡萄茎尖，并开始了葡萄低温离体保存，首创节培法Mullines 和 Srinivasan（1976）第一个报道了葡萄体细胞胚胎发生1978 年曹孜义等从欧亚品种葡萄花药培养诱导出大量二倍体植株，同年 Krul 等也从杂种葡萄花药愈伤组织上诱导出大量不定胚。
1978 年 Barlass 和 Skene 报道了葡萄试管繁殖技术1979 年曹孜义等再国内首先报道了葡萄试管繁殖技术， 并于次年建立了我国第一个植物组织培养的葡萄园齐与枢、曹孜义等历经 8 年，完成了葡萄试管繁殖生产技术试验，并取得明显的经济效益和社会效益1989 年 Mullines 在第五界国际葡萄育种学术讨论会，做了“组织培养在葡萄遗传改良育种中的应用”的大会报告，总结了这方面的研究进展七五”、“八五”期间， 国家把 “葡萄脱毒及无苗试管繁殖技术” 列入攻关计划， 组织全国有关专家协作攻关，使葡萄离体快繁技术得到了很快的发展和应用 1.2 葡萄试管快繁的意义葡萄试管快繁的意义 “葡萄试管繁殖是葡萄组织培养实际应用最多、 最有成效和最成熟的一项生物技术[1] ” 1.2.1 用语希缺良种的快速繁殖用语希缺良种的快速繁殖 对新育成或选育的单株或新引进的良种， 利用试管繁殖， 可在短期内大量提供这些急需的良种苗木，以满足生产上的需要如Harris等（1982）用巴可品种 3——4mm长的茎，4个月生产出1.2完株苗Barlass等 （1978） 培养葡萄茎尖4个月成苗8000株[21]。
” “Monette(1989)用常规硬枝扦插 1 年仅得到 12 株苗，而试管苗繁殖每月得到了 2000 株苗曹孜义、齐与枢等采用葡萄茎段培养，每月能增殖 2.4——8.2 倍，推算一个苗一年理论上可繁殖 8.76 万——222.3 万株苗，实际上已做到一株先锋试管苗一年繁殖了 3.1 万株成苗另外，一些珍惜杂交品种、纯合植株或转基因植株、多倍体植株也可用此法快速扩大繁殖 1.2.2 用于脱除病毒用于脱除病毒 葡萄病毒类型繁多，危害较大，致使葡萄产量降低，品质变劣，病毒又很难防治，成为生产上一大威胁 利用热处理和茎尖培养相结合方法能有效的脱除病毒， 该项技术已在国内外广泛应用 -1- zhaojing610@赵晶，张洁，周英，章芳玫，张丽娟，张秀琼 1.2.3 试管苗便于葡萄种质交换和保存试管苗便于葡萄种质交换和保存 葡萄试管苗无病虫，若在经过脱毒和鉴定为无病毒苗，则更便于地区间、国际间品种和种质资源的传递与交换，节省检疫和防治的人力、才力和时间用试管苗保存葡萄种质，节省大量土地、劳力和时间，也免受病虫、病毒的侵染 1.2.4 有利于病理学、生理学及其他理论研究有利于病理学、生理学及其他理论研究 利用葡萄组织培养，常年均可提供生长旺盛的苗木或组织、细胞，供病理学、生理学研究，它是筛选杀菌剂和抗病品种 及筛选植物激素的方法。
组织培养空间小，条件易控制 ，不受季节限制，在加快遗传学、细胞学、生化学研究方面均有重要意义 2.葡萄外植体的采集和消毒葡萄外植体的采集和消毒 2.1 外植体〔外植体〔explant〕是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料〕是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 组织培养所用的培养材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用 在快速繁殖中，“最常用的培养材料是茎尖，通常切块在 0.5 厘米左右[19]”，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在 0.1 毫米以下 葡萄脱毒过程中，外植体的大小与脱毒率高低成相关性，特别是茎尖培养，外植体太大不利于脱除病毒，太小又不容易培养成活，而且也不利于茎的生根所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程中应要掌握好，只要培养方法得当，用较大的茎尖作外植体，其消除病毒的效果也会很好，不一定都要用茎尖分生组织进行脱毒培养 葡萄在茎尖培养中，光的效果通常要比暗培养好一般多采用光培养的方式， “试管苗培养适宜的温度是 25+/-2 度[19] 2.2 防止外植体带菌防止外植体带菌 2.2.1 选择好外植体采集时期和采集部位选择好外植体采集时期和采集部位 2.2.1.1 外植体采集以春秋为宜； 2.2.1.2 优先选择地上部分作为外植体； 2.2.1.3 阴雨天勿采，晴天下午采集； 2.2.1.4 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。
2.2.2 室内或无菌条件下进行预培养室内或无菌条件下进行预培养 2.2.3 外植体严格灭菌外植体严格灭菌 灭菌效果实验灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌多次灭菌和交替灭菌 2.3 培养材料的消毒培养材料的消毒 2.3.1 先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的 水分吸干，并用消毒刀片切成小块先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的 水分吸干，并用消毒刀片切成小块 2.3.2 在无菌坏境中将材料放入在无菌坏境中将材料放入 70％洒精中浸泡％洒精中浸泡 30－－60 秒 2.3.3 再将材料移入漂白粉的饱和液或再将材料移入漂白粉的饱和液或 0.01％升汞水中消毒％升汞水中消毒 10 分钟 2.3.4 取出后用无菌水冲洗三、四次取出后用无菌水冲洗三、四次 2.4 制备外植体制备外植体 -2- 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体[17] 3.培养基的成分及制备培养基的成分及制备 3.1 培养基的成分培养基的成分 “ 组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的[5]。
” 因此， 培养基中应包括植物生长必需的 16 种营养元素和某些生理活性物质 所有这些物质，可概括为 5 大类： 3.1.1 无机营养物无机营养物 植物生长必须的有 13 种元素：氮（N） 、磷（P） 、钾（K） 、钙（Ca） 、镁（Mg） 、硫（S） 、铁（Fe） 、硼（B） 、锰（Mn） 、铜（Cu） 、锌（Zn） 、钼（MO） 、氯（Cl） 前六种属大量元素，后七种属微量元素培养基的各种盐类中均含有上述这些元素 无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之 铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成 3.1.2 有机物质有机物质 主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖） 、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺） ；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素（B1） 、吡哆醇（B6） 、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基（如腺嘌呤等） 3.1.3 植物生长刺激物质植物生长刺激物质 主要加入植物天然的五类激素物质及其人工合成的类似生长激素物质， 如生长素中常用的吲哚乙酸、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸；细胞分裂素中常用的有激动素、6-苄基氨基嘌呤、玉米素；赤霉素类中常用的有赤霉酸；乙烯类中常用的有乙烯和乙烯利。
3.1.4 其他附加物其他附加物 这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益 琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至 40℃即凝固为固体状凝胶 通常所说的“煮化”培养基， 就是使琼脂溶解于 90℃以上的热水 琼脂条的用量在 6—10g／L 之间，琼脂粉的用量在 3—4g／L 之间若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去若浓度过低，凝固性不好新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH 值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力 加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便， 通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面-3- 积小， 各种养分在琼脂中扩散较慢， 影响养分的充分利用， 同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。
市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是 Ca、Mg及其他微量元素因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养 其他替代物，有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小 活性炭（active carbon）可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利；•活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附通常使用浓度为 0.5—l0g／L它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的 5—羟甲基糖醛及激素等 抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在 5—20mg/L 之间添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间尤其对大量通气长期培养，效果更好。
对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入 5%—10%的抗菌素抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用， 可能某些植物适宜用青霉素， 而另一些植物却不大适应 值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成 3.1.5 其他对生长有益的未知复合成分其他对生长有益的未知复合成分 常用的为植物的天然汁液，如椰乳、酵母提取物、荸荠汁、苹果汁、生梨汁等他们的作用是供给一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等. 葡萄组织培养中，用到的培养基种类很多，最常用的是 MS 培养基，这里就将 MS 培养基配方列出。