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1、质粒质粒 DNA 的提取、定量、酶切与的提取、定量、酶切与 PCR 鉴定鉴定一、实验目的一、实验目的1.掌握 PCR 基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法 3.了解紫外吸收法检测 DNA 浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR 一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至 95，使模板 DNA 在高温
2、下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板 Tm 值的5左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温 72，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备(1).碱裂解法：染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；B.当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构
3、，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰C.A260
4、/A280 及 A260/A230 的比值可以反应 DNA 的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A2801.8 含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。4.质粒 DNA 的酶切鉴定：限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有
5、电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：三、材料与方法： （一）实验材料：（一）实验材料：1.PCR仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白 GFP)、无菌去离子水、2Premix Taq、引物2. 质粒 DNA 的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1（S1）、溶液 P2 (S2）、溶液 P3（S3）、去蛋白
6、液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH53. 质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）仪器：紫外分光光度计、比色杯、微量加样枪材料：质粒、蒸馏水4.质粒 DNA 的酶切鉴定仪器：微量加样枪、1.5ml EP 管材料：无菌水、质粒 DNA、10M 酶切缓冲液 Buf R、EcoR I(12U/ul)、Hind III (15U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶成像系统凝、胶电泳系统材料：电泳指示剂、琼脂糖、Gelview、TBE、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验方法（二）实验方法1. .PCR准备目的 DNA
7、：煮沸菌液 10 分钟，冷冻，室温解冻后离心，取上清液取 0.2 ml PCR 反应管一只，用微量加样枪照下述顺序加入：灭菌去离子水5.5l、2*Premix Taq12.5l、引物 1 (10 mol/L) 1l、引物 2 (10 mol/L) 1l、菌液 5l将装有 PCR 反应系的反应管放入 PCR 仪上进行如下操作：94预变性 5 分钟循环：9430 s，5030 s，72 1 min。循环为 30 次 72 5 分钟 4 ,保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中将 PCR 反应管置台式离心机中短时离心，以使黏附在 PCR 管壁上的液滴聚集在底部2. . 质粒质粒DNA的提
8、取与制备的提取与制备取 1.5ml 培养物加入 EP 管13,000rpm 离心 1 分钟，除上清液滴加溶液 S1 250l 并吹打分散细菌沉淀滴加溶液 S2 250l 颠倒 46 次至溶液变清亮滴加溶液 S3 350l 颠倒 68 次后 13000rpm 离心 10min 取上清液（600-800l ）吸附柱置于收集管中，将前步得上清液加入吸附柱，13000rpm 离心 2min，弃滤液滴加 500l 去蛋白液(W1)，13000rpm 离心 1min，弃滤液向吸附柱中添入 700l 漂洗液 W2， 13000rpm 离心 1min ，弃滤液空柱 13000rpm 离心 1min，室温放置
9、2min，以挥发残留乙醇取出吸附柱，放入洁净 EP 管中，在吸附膜的中加 50l 洗脱缓冲液，室温置 1 分钟，13000rpm 离心 1min 洗脱3. 质粒质粒DNA的定量（紫外分光光度法）的定量（紫外分光光度法）4. .质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定清洗比色皿：微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水洗刷 23 次后滤纸拭干空白对照比色测定 向比色皿滴入 98ul 蒸馏水，调零比色皿滴入 2l 质粒 DNA 溶液，于紫外分光光度计上测定，记录相关数据在洁净 1.5ml EP 管中依次加入下述液体 无菌水 9.0l、10M 酶切缓冲液 2.0l、质粒 DNA 7.0l、 Hind III (
10、15U/ul) 1.0l、 EcoR I (12U/ul) 1.0l小心混匀试剂，将 EP 管置 37恒温水浴箱中 1.5h5.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳四、结果与讨论：四、结果与讨论： （一）实验现象阶段操作现象调配溶液溶液混匀后为绿色透明液体PCR 扩增PCR取出样品均无明显现象质粒 DNA菌液加入 S1 并混匀白色悬浊液取质粒 DNA、经酶切反应后的 DNA 片段和 PCR扩增 DNA 各 6l 于三个 EP 管中并标记向各 EP 管滴加 1lGelview 染料，室温放置一分钟用微量加样枪分别各吸取上述样 10ul，按序号加入到电泳仪凝胶孔中电泳 30 分钟紫外光显影，保存影像500
11、0 bp3000 bp2000 bp 1500 bp 1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp加入 S2 并混匀溶液澄清加入 S3溶液有白色絮状悬浮物出现提取离心层析各过程溶液均无明显变化琼脂糖凝胶电泳点样液出现电泳现象，各溶液由正极向负极移动（二）实验结果原始实验数据测量次数 质粒 DNA 浓度（ug/ml） Ratio 比值(A260/A280) 1 84 1.94 2 107 1.763 101 1.77平均值 97 1.82电泳后的图片（四）实验分析1.实验数据分析：由上数据可知，Ratio=1.82 A260/A2801.8 含 RNA 杂质，应用 RNA 酶去
12、除，但就该数值而言，它与 1.8 较为接近，即表示 RNA 杂质并不多。2.电泳图谱分析：A 谱带中：质粒 DNA 中出现的三条带分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒DNA。三种状态 DNA 分子迁移率相异，速率最慢者为开环状分子，中者为线性分子，最快者为超螺旋 DNA 分子，故上述谱带自下而上依次是：超螺旋型 DNA、线性 DNA 和开环DNA。对比 A、B、C 谱分析，酶切反应质粒 DNA 后应含两种 DNA 片段，如图，在 C 谱中2000-3000bp 和 250-500 之间分别有两条不同的显带，上带与 B 谱水平，应为酶切长片段，下带则为含插入 DNA 片段的酶切
13、短片段。而预期酶切长片段大小在 2000bp-3500bp，短片段分子大小在 250-500bp 之间。本结果符合预期。3.实验中需注意的事项：微量加样枪的使用：在使用同支加样枪取不同液体时应更换枪头。取液时按压在第一A B C停点并释放按钮，释液时按压第二停点才释放按钮。在质粒 DNA 提取的实验加入溶液 S2 一步，应短时、轻慢，缓和颠倒。在电泳实验中，点样时防止气泡产生，且应防止移液枪回吸点样液，即当枪头离开液面方释放按钮。思考题：（1）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？溶液 I 用于金属离子螯合以抑制脱氧核酸酶降解 DNA；有利于溶酶体作用。溶液 II：使细胞壁肽聚糖在碱性下水解，并让核酸和蛋白变性。溶液 III：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性蛋白-SDS+线性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 1/10 体积，而且最大反应体系最好不要小于 20 ul，且酶切反应中甘油浓度应低于 5%。底物 DNA 的纯度：主要污染 DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如 NaCl 和 Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应。
