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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, January 25; 24(1): 153-158 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2008 Institute of Microbiology, CAS Accepted: June 11, 2007 Supported by: the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AAZ323), the Major Pr
2、ogram of Shanghai Education Commission(No. 04KA01), the project of Dengshan Plan of Shanghai Science Commission (No. 06dz12015) and the Prepon- derant Subject Program of Shanghai Education Commission(No. Y1101). Corresponding author: Peimin He. Tel: +86-21-65710023; Fax: +86-21-65710023; E-mail: 国家
3、高技术研究与发展计划(863 计划)项目(No. 2006AAZ323)、上海市教委重点项目(No. 04KA01)、上海市科委登山计划项目(No:06dz12015)和上海市教委优势(重点)学科项目(No. Y1101)资助。 研究简报条斑紫菜 R-藻红蛋白荧光探针制备条件优化 周 铭, 蔡春尔, 柳俊秀, 吴维宁, 何培民 上海水产大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室, 上海 200090 摘 要: 通过化学方法使条斑紫菜 R-藻红蛋白与抗体进行交联以制备荧光探针, 并对制备条件进行优化。首先采用异双功能试剂 SPDP (N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶基二硫丙酸醇)和 DTT（二
4、硫苏糖醇）分别使 R-PE(R-藻红蛋白)衍生化、IgG（单克隆抗体）巯基化, 其次测定了 SPDP 与 R-PE 不同摩尔比对 R-PE 衍生化的影响、DTT 与 IgG 不同摩尔比对IgG 巯基化的影响, 结果表明： SPDP 与 R-PE 的最佳摩尔比为 40： 1, DTT 与 IgG 的最佳摩尔比为 500:1。 在此基础上, 建立了 R-PE 与 IgG 交联的制备技术, 并应用全波长扫描吸收光谱、电泳分析和荧光显微镜观察等监测和分析技术, 证实了藻红蛋白与抗体已成功交联形成了复合物。 关键词: R-藻红蛋白, 单克隆抗体, 交联, 荧光探针, 制备, 条件优化 Optimizat
5、ion of Fluorescence Probe Preparation for R-Phycoerythrin in Porphyra yezoensis Ming Zhou, Chuner Cai, Junxiu Liu, Weining Wu, and Peimin He Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Aquacultural Ecology Certificated by the Ministry of Agriculture, Shanghai Fisheries University, Shanghai 20009
6、0, China Abstract: We optimized the chemical conjugation between R-phycoerythrin and antibody. First, the R-PE (R-phycoerythrin) was derived with beterobifunctional reagent SPDP(N-succinimidyl-3-2-pyridyldithio propionate) and antibody was thiolated with DTT(dithiothreitol). Second, we determined th
7、e effects of the different molar ratio of SPDP to R-PE for the derivation and DTT to IgG for the thiolation. The results showed that the optimum molar ratio of SPDP to R-PE for derivation was 40:1, and DTT to IgG for thiolation was 500:1. The conjugation between R-phycoerythin and antibody was furth
8、er done for fluorescence probe preparation. R-phycoerythin was conjugated with IgG and formed a probe complex by whole wavelength scanning, electrophoresis (Native-PAGE) and fluorescence microscope observation. Keywords: R-phycoerythrin, IgG, conjugation, fluorescence probes, preparation, optimizati
9、on 藻胆蛋白是一类纯天然荧光物质, 包括藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和和藻红蓝蛋白1, 它们作为荧光示踪物质, 正被广泛应用于免疫标记与肿瘤 光 动 力 治 疗 等 领 域2。 特 别 是 R- 藻 红 蛋 白154 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2008 Vol.24 No.1 J (R-Phycoerythrin, R-PE)因其极高的消光系数和量子产率, 较大的STOKES位移, 以及黄橙色特征荧光, 可以避开多数生物环境中的内源荧光分子的干扰, 制成的荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物3。 但由于荧
10、光探针制备工艺难度较大, 所用的藻红蛋白及单克隆抗体的纯度要求又较高, 使目前国内科研和医疗单位使用的PE荧光标记物完全依赖进口, 成为限制其扩大应用的瓶颈4。 此外, 虽然近年国内外对PE及荧光免疫检测的研究有一定的进展, 但大多数还停留在实验室水平, 且由于各实验所用材料的不同, 因而导致在使用试剂的种类、用量及交联物的制备流程上都存在较大差异。本实验在前人研究基础上, 以自制的高纯度条斑紫菜R-PE为材料, 着重探讨了交联试剂与物质摩尔比对交联效果的影响, 对整个交联过程进行了条件优化和质量跟踪, 并初步制备了高纯度R-PE荧光标记的第二抗(羊抗兔抗体), 为建立高质量、低成本且简便的荧
11、光探针制备工艺奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 条斑紫菜的 R-PE 由上海水产大学生命学院藻类生物技术实验室制备和提供经非变性电泳检测其相对分子量约 120 kD, 其分离与纯化方法见文献5。 羊抗兔 IgG 购自华美生物工程公司。 1.2 R-藻红蛋白脱盐与纯度检测 将R-PE用磷酸盐缓冲液透析脱盐, 用紫外分光光度计(Ultrospec 2000 型, Pharmacia公司)扫描测定其浓度和纯度, R-PE的浓度和纯度测定方法参见文献5, 6。用Native-PAGE电泳检测其电泳纯度, 方法参见文献6。 浓度计算公式为： 浓度(C)= 0.123A564nm0.068A615
12、nm + 0.015A650nm (单位：mg/mL) 注： A564nm、 A615nm、 A650nm分别为溶液在 564 nm、615 nm、650 nm处的吸收值。 纯度计算公式为： 纯度(564nm/280nm)= A 564nm/ A280nm 注：A564nm、A280nm分别为溶液在 564nm、280nm处的吸收值。 1.3 藻红蛋白衍生化 采用异双功能试剂衍生化法,步骤参见文献7。R-PE溶液中分别加入适量SPDP (N-succinimidyl- 3-2-pyridyldithio propionate N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶基二硫丙酸醇)溶液避光振荡后脱盐去除未
13、反应的SPDP, 收集产物并用全波长扫描测定吸收光谱。取出适量衍生化的R-PE, 加入DTT(dithiothreitol 二硫苏糖醇)溶液后全波长扫描测定吸收光谱, 衍生化成功的R-PE会与DTT反应生成了 2-硫醇吡啶将在A343nm产生特征吸收峰, 故可以此特征吸收峰来检测衍生化效果及成功与否8。 1.4 抗体巯基化 抗体采用DTT巯基化法, 步骤参见文献7。IgG溶液中加入适量DTT溶液低速振荡后脱盐柱未反应的DTT, 收集产物并用全波长扫描测定吸收光谱。 取出适量巯基化的抗体, 加入 DTNB(5, 5-Dithiobis 2-nitrobenzoic acid 二硫硝基苯甲酸)后全
14、波长扫描测定吸收光谱, 巯基化成功的IgG含有自由的巯基能与DTNB(二硫键相连的TNB)发生反应,释放出的生色物TNB将在 412 nm产生吸收值, 可以此吸收值来检测巯基化效果及成功与否8。 1.5 R-PE 与抗体交联反应 R-PE与抗体交联反应：方法参见文献9。衍生化的R-PE与巯基化的IgG混合低速震荡过夜, 采用NEM(N-Ethylmaleimide N-乙基马来酰亚胺)与自由巯基结合, 终止交联反应10。 1.6 交联反应检测 硝酸纤维素膜(NC膜)荧光显微镜镜检方法参见文献11: 以荧光抗体作为第二抗体, 用 1, 5 二磷酸核酮糖羧化酶(RUBISCO)作为第一抗体检测其交
15、联效果。用荧光显微镜镜检( PH 型, Olympus 公司)。同时设置空白对照, 并以 SPDP 衍生化藻 R-PE 作阴性对照。 1.7 实验设计 1.7.1 SPDP与R-PE摩尔比对R-PE衍生化效果影响 在等量的 R-PE 溶液中加入不同量的 SPDP, 使SPDP 与 R-PE 摩尔比分别为 0 (空白对照)、 2.5 、 5、10、20、40、80、160、320。按上述方法对 R-PE 衍生化, 最后加入DTT后, 全波长扫描测定吸收光谱。 1.7.2 DTT与IgG摩尔比对于IgG巯基化效果的研究 在等量的 IgG 溶液中分别加入不同量的 DTT,使 DTT 与 IgG 摩尔比分别为 0 (空白对照)、100 、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800。按上述方法对 IgG 巯基化, 最后加入 DTNB 后, 全波长扫描测定吸收光谱。 1.8 R-PE 和 IgG 交联物的制备 按上述方法交联, 其产物进行过柱分离纯化12：柱填料为Sephacryl S-300HR(排阻极限为 400 kD, 周铭等:
