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1、关于生物技关于生物技术综术综合合实验报实验报告告生物技术综合实验甘薯-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者：谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH具有多种重要生理功能,抗自由基和抗氧化应激作用,保护细胞膜的完整性等。-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶,可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用,说明-GCS也与植物抗逆过程密切相关。实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1.了解真核生物RNA提取的原理； 2.掌握Trizol提取的方法和步骤。二、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍
2、配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯
3、仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料1.材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2.试剂无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；Trizol试剂；氯仿；异丙醇、75乙醇； TBE缓冲液；上样缓冲液3.仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP管架四、实验方法1.将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mLTrizol试剂，室温放置5min，使样品充分裂解；2.每1mLTrizol试剂加
4、入200L氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相；3.412,000rpm离心15min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min；4.412,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底；5.RNA沉淀中加入1mL75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；48,000rpm离心2min，弃上清； 6.室温放置10min晾干沉淀；7.沉淀中加入20LRNase- freeddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70保存；8.用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。五、实验结果1.RNA提取结果依照Trizol试剂盒方法，提
5、出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。2.RNA后电泳结果如图1.其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。图1.RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。六、分析与讨论1.RNA的提取产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。 2.RNA电泳结果有EB存在时，电泳后28Sr
6、RNA和18SrRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA，rRNA和5SrRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28SrRNA的亮度应为18SrRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1.9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂
7、入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。七、总结：本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1.2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现
8、类似问题。实验二第1链cDNA的合成和模板的验证一、实验目的1.掌握第1链cDNA的合成方法和步骤二、实验原理真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：OligodT。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT- PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是
9、在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。三、实验材料1.材料 徐薯18叶片RNA样品 2.试剂dNTPmixture；Oligo(dT)Primer(10M)； TotalRNA； RNasefreeddH2O； M-MLV反转录酶；5First-strandBuffer； MDTT；RibonucleaseInhibitor(40U/L) 3.仪器10L和100L的移液枪、的EP管、PCR仪等四、实验方法1.在RNasefreeMicrotube管中配制下列混合液： dNTPmixture1L*Oligo(dT)Primer(10M)4L TotalRNA2L 生物技术综合实验报告实验一工作
10、液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌一、实验目的掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法； 掌握高温高压灭菌的方法。二、原理培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。湿热条件(121的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。三、器具和试剂灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2,4-D，IBA，KT，1MNaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮。四、实验内容PH调节剂的配制、培养基母液的配制
11、、培养基的配制、各种相关物品的准备培养基的配制步骤1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。 3、用NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。 5、高压灭菌棉花无菌苗培养基的制备1、取25mlMS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为，加入/l琼脂煮沸。2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。4、灭菌后臵于水平的工作台上冷却即可。要求：配制1L 拟南芥无菌苗培养
12、基的制备1、拟南芥无菌苗培养基：1/2MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值；加入琼脂高温高压灭菌。2、%琼脂糖：琼脂糖/100ml蒸馏水；无菌苗培养基和%琼脂糖均121高压灭菌15分钟。3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。要求：配制，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。五、注意事项1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻
13、璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。实验二无菌苗的制备一、原理化学灭菌：%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。 二、实验材料、器具和试剂棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。%升汞溶液，84消毒液，75%酒精 三、实验内容拟南芥无菌苗培养基倒皿1.取上次灭菌好的拟南芥培养基，稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。
14、2.将上次灭菌好的9cm培养皿分开放臵超净工作台上。3.将融化好的培养基分装于培养皿中，将皿至于超净台上吹干.。 共培养培养基的配制成分数量成分数量MS大量元素(20倍）50ml2,4-D(/ml)1mlNH4NO3(20倍)50ml甘氨酸(1000倍)1ml微量元素(100倍)10mlKT(/ml)1ml 铁盐(100倍)10ml葡萄糖30g/L微生素(1000倍)1mlPH值肌醇(100倍)1ml依次加入上述物质，调PH值，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。选择培养基的配制共培养培养基+卡那霉素50mg/L+头孢霉素400mg/L灭菌后，待培养基凉至60度
15、左右加入，混匀，倒皿。棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳。2、用%的升汞灭菌13分钟。3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。 4、28条件下暗培养7天。 拟南芥无菌苗的制备大量法灭菌：将拟南芥种子放入离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加入1ml75%的酒精混匀1min，然后无菌水清洗4次；加入%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，吹干，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周。五、注意事项所有操作均在超净工作台上进行。六、实验结果一周后观察无菌苗的生长状况1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其
16、余五瓶生长状况良好。2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。实验三愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化一、实验目的掌握植物体细胞胚胎发生的基本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进一步巩固植物离体培养和无菌操作的步骤；掌握植物遗传转化的方法、理论；掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。二、实验原理植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。愈伤组织：胚性愈伤：呈淡黄色或者黄绿色，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核大，细胞质浓非胚性愈伤：呈褐色、白色粉末状或白色、绿色坚硬块状；细胞一般为长柱状等非规则形状，细胞核小，细胞质较稀。农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T- 链蛋白复合体，通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。三、材料与用品1、
