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1、三、功能基因组学三、功能基因组学完成一个生物体全部基因组测序后即进入后基因组阶完成一个生物体全部基因组测序后即进入后基因组阶段段详尽地分析序列，描述基因组所有基因的功能，包详尽地分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式，这就是括研究基因的表达及其调控模式，这就是功能基因组学功能基因组学（functional genomics）。）。 HGP计划在完成测序后，进入到后基因组时代，即计划在完成测序后，进入到后基因组时代，即功能基因组学功能基因组学的研究。的研究。其主要内容包括：建立以其主要内容包括：建立以SNP为代表的为代表的DNA 序列变异系统目录，揭示人序列变异系统目
2、录，揭示人类疾病和其他生物学性状的遗传学基础；阐明基因组在转录和翻译水平的类疾病和其他生物学性状的遗传学基础；阐明基因组在转录和翻译水平的表达及其调控机制；通过对不同进化阶段模式生物基因组序列的比较，找表达及其调控机制；通过对不同进化阶段模式生物基因组序列的比较，找出基因组的结构组成与功能调节之间的关系和规律，在多基因控制的疾病出基因组的结构组成与功能调节之间的关系和规律，在多基因控制的疾病定位及生物信息学理论和算法研究等方面也取得了较大的突破。定位及生物信息学理论和算法研究等方面也取得了较大的突破。（一）功能基因组学研究策略及主要内容（一）功能基因组学研究策略及主要内容1 .1 . 鉴定鉴定
3、D N AD N A 序列中的基因序列中的基因对基因组序列进行注释，包对基因组序列进行注释，包括鉴定和描述推测的基因、非基括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及其功能。因序列及其功能。（一）（一）功能基因组学研究策略及主要内容功能基因组学研究策略及主要内容同源基因在进化中来自共同的祖先，通同源基因在进化中来自共同的祖先，通 过核苷酸序列或氨基酸序列的同源性比过核苷酸序列或氨基酸序列的同源性比 较推测基因组内相似功能的基因。较推测基因组内相似功能的基因。2.同源搜索分析基因功能同源搜索分析基因功能3.描述基因表达模式描述基因表达模式转录组转录组(transcriptome):一个细胞内的一套一个细
4、胞内的一套mRNA转录物，包含了某转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理(功能功能)状态下，生命体的细胞或组织所表达的状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。基因种类和水平。这一研究领域叫转录组学这一研究领域叫转录组学(transcriptomics)。（二）功能基因组学的主要分析方法（二）功能基因组学的主要分析方法功能基因组学是基因组信息学研究的核心内容，功能基因组学是基因组信息学研究的核心内容， 主要采用高通量的试验方法结合大规模的数据统计主要采用高通量的试验方法结合大规模的数据统计 计算对基因组序列进行研究。功能基因组学
5、的研究计算对基因组序列进行研究。功能基因组学的研究 方法是一个崭新的研究领域，其内容正在不断更新方法是一个崭新的研究领域，其内容正在不断更新 和完善。目前常用的方法是基因表达差异显示技术、和完善。目前常用的方法是基因表达差异显示技术、 基因表达连续分析技术（基因表达连续分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）、）、DNA微阵列分析以及生物微阵列分析以及生物 质谱分析（质谱分析（biological mass spectrometry analysis）技术等。）技术等。1.基因表达差异显示法基因表达差异显示法生物表现出的各种性状，主要是由于基因
6、的选择性表达引生物表现出的各种性状，主要是由于基因的选择性表达引起的。而这些特定基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行起的。而这些特定基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。差异显示表达法是着，这种表达的方式即为基因的差异表达。差异显示表达法是根据基因表达的差异来分离和克隆基因的，省去了分子标记定根据基因表达的差异来分离和克隆基因的，省去了分子标记定位分析的繁琐程序，并能同时分离多个未知产物的差异表达基位分析的繁琐程序，并能同时分离多个未知产物的差异表达基因。由于原理简单，技术难度较小，所以先后开发出众多的差因。由于原理简单，技术难度较小，所以先后开发出众多
7、的差异分离技术。主要有异分离技术。主要有mRNA差异显示逆转录差异显示逆转录PCR（mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）以及抑制性差减杂交法（以及抑制性差减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）等技术。）等技术。抑制性差减杂交（抑制性差减杂交（SSH）原理）原理SSH技术利用抑制性技术利用抑制性PCR能选择性扩增不同丰度差异基能选择性扩增不同丰度差异基因和因和cDNA 消减杂交特点消减杂交特点,运用杂交二级动力学原理（即高丰运用杂交二级动力学原理（即高丰度
8、序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）,使原本使原本不同丰度的不同丰度的DNA序列相对含量趋于一致。然后利用抑制性序列相对含量趋于一致。然后利用抑制性PCR特点特点,两端接上同一接头的反向重复序列两端接上同一接头的反向重复序列,在退火时容易形在退火时容易形成发夹互补结构成发夹互补结构,在在PCR中不能作为模板与引物配对扩增中不能作为模板与引物配对扩增,从而从而选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增。消减杂交选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增。消减杂交扣除了实验组和对照组之间同源序列扣除了实验组和对照组之间同源序列,再结合抑制性再结
9、合抑制性PCR的动的动力学富集力学富集,实现高效分离低丰度特异性非同源片段。实现高效分离低丰度特异性非同源片段。Outline of subtractive suppression hybridisation （SSH）2. 基因表达连续分析法（基因表达连续分析法（ serial analysis of gene expression，SAGE）SAGE通过快速和详细分析成千上万个通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达来寻找出表达 丰度不同的丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表标签序列，从而接近完整地获得基因组的表 达信息。它的显著特点是能够大量获取基因组范围基因表
10、达的达信息。它的显著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的 类别与丰度。类别与丰度。SAGE区别于区别于SSH等其它技术的主要特点是可用于寻找那等其它技术的主要特点是可用于寻找那 些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息， 这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的 首选策略。并可在此基础上，发现新的基因。首选策略。并可在此基础上，发现新的基因。SAGE技术的理论基础：一段来自于任一转录本特定区域技术的理论基础：一段来自于任一转录本特定区域的“标签”（的“标签
11、”（Tag），即长度仅），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个标已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个标记位点上随机分布的记位点上随机分布的9bp的的SAGE标签理论上可以区别标签理论上可以区别49（262144）个转录物（基因）。而人类基因组据估计仅编码）个转录物（基因）。而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。如果将短片段标签相互连接、集一种转录本的特征序列。如果将短片段标签相互连接、集中形成长的中形
12、成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的数以千计的mRNA转录本进行批量分析。各转录本的表达转录本进行批量分析。各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数定量。水平可以用特定标签被测得的次数定量。SAGE技术的原理图技术的原理图3.基因芯片表达技术基因芯片表达技术 （DNA Microarray）利用基因芯片技术同时将大量的探针固定于支持物上，一次可以对数利用基因芯片技术同时将大量的探针固定于支持物上，一次可以对数 千种千种DNA分
13、子进行检测和分析分子进行检测和分析, 整个检测过程快速高效。因此，整个检测过程快速高效。因此，DNA微微 列阵技术在基因表达谱分析、基因突变和多态性分析以及基因组在不同列阵技术在基因表达谱分析、基因突变和多态性分析以及基因组在不同 时期整体转录表达等方面有着重要的应用价值。时期整体转录表达等方面有着重要的应用价值。功能基因组学常用功能基因组学常用的研究方法的研究方法D N AD N A 芯片技术芯片技术4 .生物质谱分析生物质谱分析质谱分析是在真空系统中将样品分子离解成带电的离子质谱分析是在真空系统中将样品分子离解成带电的离子,并并通过对生成的离子的质量和强度测定，而进行样品成分和结构通过对生
14、成的离子的质量和强度测定，而进行样品成分和结构分析的一种研究方法。生物质谱已成为分析生物大分子如核酸、分析的一种研究方法。生物质谱已成为分析生物大分子如核酸、蛋白质、糖类以及对功能基因组和蛋白质组进行高通量、大规蛋白质、糖类以及对功能基因组和蛋白质组进行高通量、大规模筛选的重要方法。近年来用于生物大分子分析的生物质谱方模筛选的重要方法。近年来用于生物大分子分析的生物质谱方法主要有：电喷雾电离质谱（法主要有：电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱）和基质辅助激光解吸电离质谱（matrix as
15、istanted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-MS）等。）等。MolecularsIons生物质谱技术生物质谱技术Mass Spectrometry： 通过测定样品离子的质荷比（通过测定样品离子的质荷比（m/z） 来进行成分和结构分析。来进行成分和结构分析。基质辅助激光解吸电离（基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术是将样品分散在）技术是将样品分散在 基质分子中并形成固态或粘滞态，当用激光照射基质时，基质基质分子中并形成固态或粘滞态，当用激光照射基质时，基质 分子吸热并迅速升华，使得基质与其中的样品一起被离子化，分子
16、吸热并迅速升华，使得基质与其中的样品一起被离子化， 这些电荷离子在高压电场中被加速，通过检测其飞行时间即可这些电荷离子在高压电场中被加速，通过检测其飞行时间即可 推算出质量大小。推算出质量大小。MALDI产生的单电荷离子常通过飞行时间产生的单电荷离子常通过飞行时间 （time of flight，TOF）质量分析器来检测，只要飞行管的长）质量分析器来检测，只要飞行管的长 度足够长，度足够长，TOF检测器可检测分子的质量数是无限的。所以检测器可检测分子的质量数是无限的。所以 MALDI-MS常与常与TOF一起连用，称为基质辅助激光解吸电离飞一起连用，称为基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术。技术。 MALDI-TOF-MS技术的技术的 优势非常明显：样品可以是高浓度缓冲液、无机盐、有机化合优势非常明显：样品可以是高浓度缓冲液、无机盐、有机化合 物和其它非挥发性物质；检测灵敏度很高，分子量检测范围更物和其它非挥发性物质；检测灵敏度很高，分子量检测范围更 宽。新型宽。新型MALDI-T
