《农学专业论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农学专业论文（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本科生毕业论文（设计）本科生毕业论文（设计）题 目: 农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化 目目 录录摘要 .3 关键词 .3 Abstract .3 Key Words .3 1 材料与方法 .4 1.1 材料.4 1.1.1 植物材料 .4 1.1.2 菌株和载体 .5 1.1.3 培养基 .5 1.1.3.1 农杆菌培养基.5 1.1.3.2 烟草组织培养基.5 1.1.4 主要试剂 .5 1.2 方法.5 1.2.1 农杆菌介导法转化烟草 .5 1.2.1.1 受体材料准备.5 1.2.1.2 农杆菌的培养.6 1.2.1.3 农杆菌侵染外植体及培养.6 1.2.2 转基因烟草的分
2、子鉴定 .6 1.2.2.1 转基因烟草 DNA 的提取.6 1.2.2.2 PCR 鉴定 .7 1.2.2.3 转基因烟草 RNA 的提取.7 1.2.2.4 cDNA 的合成 .8 1.2.2.5 RT-PCR 检测 .8 2 结果与分析 .9 2.1 影响根癌农杆菌转化烟草的因素.9 2.1.1 菌液浓度对转化效率的影响 .9 2.1.2 侵染时间对转化率的影响 .9 2.1.3 共培养时间对转化效率的影响 .10 2.1.4 预培养时间对转化效率的影响 .10 2.2 转基因植株的获得及分子检测（PCR、RT-PCR）.11 2.2.1 转基因植株的获得 .11 2.2.2 转基因植株
3、的分子检测 .11 3 讨论 .12 致谢 .13 参考文献 .13农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化摘要：利用农杆菌介导的方法将GmftsH基因转入三生烟烟草中，将0.5cm0.5cm烟草外植 体浸泡在培养好的农杆菌悬浮液中，震荡45分钟，然后置于MS1固体培养基上，在25的 组织室内共培养2天，待再生幼苗根系发达后，将不定芽进行移栽从而获得了三生烟烟草转 化植株。再经PCR检测，为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带，初步 表明GmftsH基因已经转到这些烟草基因组中。最后通过RT-PCR反应进行阳性转基因植株 GmftsH基因在转录水平的检测，在转基因烟草中能够扩增出
4、特异条带，而在野生型烟草对照中没有检测到特异条带，说明该基因在RNA水平上得到表达。关键词：GmftsH 基因；烟草；农杆菌；遗传转化；PCR 鉴定GmftsH agrobacterium-mediated genetic tobacco genetic transformationAbstract：In the way of agrobacterium-mediated,putting GmftsH gene into Sansheng tobacco, then we make 0.5 cm x 0.5 cm tobacco explant soaked in cultivating go
5、od agrobacterium suspension, Concussing 4 to 5 minutes, then placed on MS1 solid medium, and Altogether training for two days in 25 organization indoor.After regeneration seedling root developed enough，transplanting adventitious bud thereby obtaining Sansheng tobacco conversion plants.PCR assay is t
6、he common way to validate the transgenic Plant, specific corresponding fragment was amplified by PCR detectionIt showed that GmftsH gene has been transferred into tobacco. Finally through RT - polymerase chain reaction, detecting positive GmftsH gene transcription of transgenic plants level, In tran
7、sgenic tobacco could amplify specific bands, whereas in wild-type tobacco control in the specific band was not detected, indicating that the gene was expressed at the RNA level.Key words: GmftsH gene；tobacco；agrobacterium；transformation; PCR assay在植物基因工程中，目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方法便是 根癌农杆菌介导的遗传转化技术。在已获得
8、的近 200 种转基因植物中约有 80 是由农杆菌介导完成的1 1。近年来，这种纯生物的方法由于具有转化率高，可导入大片段 DNA，且导入基因的拷贝数低，表达效果好，仪器和操作技术较 简单等优点，引起了人们的极大关注2 2。该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传转化技术体系，为分子生物学和植物基因工程的研究提供较好 的技术基础。 而 FtsH 基因广泛分布于原核生物和真核生物中，其生物学功能也多种多样。 FtsH 基因与热激、高渗、光胁迫、冷诱导、病害等逆境胁迫有着不可分割的联 系3-83-8，说明 FtsH 参与胁迫反应，但其确切的作用机制还不清楚，所以利用农杆菌介导的方法先将 Fts
9、H 基因成功转入烟草中，可对 FstH 基因在烟草中的表达特性和生理功能的验证做良好的实验基础，为下一步的外源基因的遗传稳 定性的检测也做了铺垫。1 1 材料与方法材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料烟草三生烟种子，将野生型烟草种子种植在营养土中，25条件下培养 40- 60 天左右。1.1.2 菌株和载体本研究采用根癌农杆菌（EHA105）菌株为本实验室保存。植物过表达载体 为 pMDC-83，具有潮霉素抗性，可以进行初步筛选。1.1.3 培养基1.1.3.1 农杆菌培养基YEB 培养基：酵母提取物（5g/l）+蔗糖（5g/l）+蛋白胨（5g/l）+七水硫 酸镁（0.5g/l）+琼脂（
10、15g/l）pH7.2。121高压灭菌锅灭菌 1.1.3.2 烟草组织培养基MS1（共培养）：即 MS 培养基pH7.2。121高压灭菌锅灭菌 MS2（选择）：MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+头孢 50ug/ml pH7.2。121高压 灭菌锅灭菌 MS3（生根）：1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 0.2mg/ml pH7.2。121高压灭菌锅灭菌1.1.4 主要试剂（1）植物生长激素：6BA 200ug/ml，IAA 0.2mg/ml （2）抗生素：Hyg 50ug/ml，Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，头孢霉素 50ug/ml （3）TE 缓冲液(pH=8.0)： 1ommol/Ltris-Cl(PH=8.0) lmmol/LEDTA(pH=80) （4）氯仿:异戊醇： 按体积比 24:1 混合平衡氯仿和异戊醇，放于棕色试剂瓶中，4保存。 （5）电泳缓冲液 TAE（50）： 每升含:242 克 Tris 碱；57.lml 冰乙酸；10Om10.smol/LEDTA(PH=8.0) (使用缓冲液为 1ATE) （6）植物总 DNA 提取试剂(2XCTAB，pH=8.0)： 每升含：7.444 克 ED
