紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的 1. 学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理； 2. 掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术 二、实验原理 1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸 收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等本实验采用 紫外分光光度法 2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质 具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于 280nm 附近（不同蛋白质略有不同） 在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律 利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些 与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法 适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶 等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰 三、仪器与试剂 TU―1901 紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液 3.00mg·mL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液10mL 比色管、1cm 石英比色皿、吸量管 四、实验步骤 1.绘制吸收曲线 用吸量管吸取 2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于 10mL 比色管中，用 0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
用 1cm 石英比色皿，以 0.9%NaCl 溶液作参 比溶液，在 190~400nm 间每隔 5nm 测一次吸光度 Abs，记录数据并作图 2.绘制标准曲线 用吸量管分别吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液 于 10mL 比色管中，用 0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀用 1cm 石英比色皿， 以 0.9%NaCl 溶液作参比溶液，在波长 280nm 处分别测其吸光度，记录数据并 作图 3.样品测定 取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长 280nm 处测其吸光度，重复三次在 已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在 标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363） ，估 算浓度为 2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至 5 倍（即取 2mL 试液，用 0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀） ，估算浓度为 0.4192 mg·mL-1，测吸光度， 重复三次 五、数据处理与结果分析表 1 绘制吸收曲线的相关数据 λ/nmAbsλ/nmAbsλ/nmAbsλ/nmAbs400-0.00334502900.2042351.604395-0.0033400.0012850.342302.673390-0.0033350.0012800.392253.094385-0.0033300.0022750.3772203.003380-0.0023250.0022700.3292152.829375-0.0023200.0032650.2782102.584370-0.0023150.0042600.232052.103365-0.0013100.0072550.1882000.648360-0.0023050.0132500.1841950.443355-0.0013000.0312450.2751900.384350-0.0012950.0782400.65-------0.0030.4970.9971.4971.9972.4972.9973.497050100150200250300350400450 λ/nmAbs系列1图 1 吸收曲线在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长 225nm 处的吸收峰远 大于 280nm 处，这是由于在波长 250nm 以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大， 所以，蛋白的最大吸收波长应为 280nm。
表 2 绘制标准曲线的相关数据浓度 c/mol·L-10.30.450.60.750.9Abs0.2170.2970.4080.510.591y = 0.6407x + 0.0202 R2 = 0.996900.10.20.30.40.50.60.700.20.40.60.81 浓度c/mol·Lˉ¹Abs系列1 线性 (系列1)图 2 标准曲线表 3 标准曲线（y=ax+b）的相关数据abR20.64070.02020.9969将试样所测得吸光度带入标准曲线中求蛋白质含量： 稀释以后的蛋白质的浓度 cx=(Abs-0.0202)/0.6407 原试样中蛋白质浓度 c=(cx*10)/2表 4 计算结果Abs0.3100.2850.283cx/mg·mL-10.45230.41320.4101c/mg·mL-12.2612.0662.051平均值c/μg·mL-12.126|c-c|/μg·mL-10.1350.0600.075 所测蛋白质试样的浓度约为 2.126mg·mL-1. 单次测定的标准偏差:s =1)(12 nccnii=2075. 0060. 0135. 0222=0.12相对标准偏差： sr =×100% ==5.5%cs%100126. 212. 0。