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1、玉米叶色突变的研究概况玉米叶色突变的研究概况玉米是世界上广泛种植的产量最大的作物，它不仅是粮食，饲料的重要来源，也是工业酒精和烧酒的主要原料，由于其广泛的用途使玉米在世界的农业生产中占有重要的地位(陈彦惠，1996)，玉米产量的持续提高对保持粮食安全有重要的意义。高产性状包括协调的源(叶)库(籽粒)关系、合理的株型、优良的产量因素组成(亩株数、穗粒数、粒重)和高光效等四个部分组成。叶色突变往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，对叶色突变体的深入研究，对阐明光合作用调控机理和利用基因工程提高作物的光合效率，进而增加作物的产量具有重要的理论意义。11 玉米基因组学研究玉米基因组学研究1986 年
2、美国科学家 Thomas Roderick 提出了基因组学(Genomics)，指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics)，又被称为后基因组(postgenome)研究。随着结构基因组学的发展，比较基因组学(Comparative Genomics)也快速发展起来。111 玉米结构基因组研究玉米结构基因组研究结构基因组学(struc
3、tural genomics)是基因组学的一个重要组成部分和研究领域，它是一门通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。染色体不能直接用来测序，必须将基因组这一巨大的研究对象进行分解，使之成为较易操作的小的结构区域，这个过程就是基因作图。根据使用的标志和手段不同，作图有三种类型，即构建生物体基因组高分辨率的遗传图、物理图谱、转录本图。因此结构基因组学研究内容主要包括以下几个层面： 遗传图谱：利用各种 DNA 多态性，如RFLP、AFLP、SSR、RAPD 等分子标记手段，通过计算遗传标记之间的重组频率，建立遗传连锁图谱；物理图谱：通过构建全基因组 YAC、BAC、粘粒文库等，采
4、用如EST、STS 等标记手段，根据文库克隆之间重叠序列确定片断间的连接顺序和遗传标记间的物理距离； 序列图谱：根据物理图谱将基因组分为若干具有标识的区域进行测序分析，在同一区域内需要利用 DNA 片断重叠群使测序工作得以不断延伸或采取全基因组鸟枪法等策略，直至完成全基因组测序(赵晋平，2006岳思君，2005田清震，2006)。1111 分子标记的研究进展分子标记的研究进展分子标记有广义和狭义之分，广义的分子标记是指可遗传的并可检测的 DNA 序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA 片段又称 DNA 标记。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异
5、为基础的遗传标记，是 DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA 分子标记具有更大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA 都可用于标记分析；分子标记揭示来自 DNA 的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在 DNA 分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记根据其技术基础，大致可
6、分为三大类，第一类是基于 DNA 杂交技术的分子标记，如 RFLP(限制性片段长度多态性)标记(Grozdicker 等，1974)；第二类是基于PCR 技术的分子标记，如 SSR(简单序列重复)标记(Hamade 等，1982)、RAPD(随机扩增多态性 DNA)标记(Wiliams 等，1990)、AFLP(扩增片段长度多态性)标记(Zabeau 等，1993)、ISSR(简单重复间序列)标记(Zitkiewicz 等，1994)；第三类是基于已知序列的新型分子标记，如 SRAP(相关序列扩增多态性)标记(Li 等，2001)、TRAP(靶位区域扩增多态性)标记(I-Iu 等，2003)、
7、SNP(单个核苷酸多态性)标记。1.限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)1974 年 Grodzicker 等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA-_DNA 杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP 基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组 DNA，得到大小不等的 DNA 片段，所产生的DNA 数目和各个片段的长度反映了 DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆 DNA 探针进行 Southern 杂交和放射
8、显影，即获得反映个体特异性的 RFLP 图谱。它所代表的是基因组 DNA 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。2.简单重复序列简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)是指在真核生物基因组中分布着由 24 个碱基对组成的简单重复序列，又称微卫星 DNA 其中最常见是双核昔酸重复，即(CA)n 和(TG)n 每个微卫星 DNA 的核心序列结构相同，重复单位数目 1060 个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫
9、星序列两端互补序列设计引物，通过 PCR 反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用 PCR 的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR 序列的侧翼具有保守的 DNA 序列，其多态性明显高于 RFLP 及其它分子标记，且操作简便快速，表现为共显性和孟德尔遗传，在基因组中分布趋于随机。它以高度的多态性信息量和 PCR 技术的方便性使其表现出更大的优势，人们把用 SSR 标记建立的连锁图称为继 RFLP 连锁图谱之后的第二代遗传图谱，在作物中利用已测序的 EST 序列，BAC 序列，BAC 末端序列寻找重复序
10、列，通过侧翼保守序列设计引物，开发 SSR 标记，被广泛的应用于基因的精细定位。目前 SSR 标记已被广泛用于资源鉴定、连锁图谱绘制及目标性状基因的标记等研究上。3.核苷酸多态性核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP 是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1000 bp SNP 出现一次，已有 2000 多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术
11、。SNP 被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技术。Ching 等研究了美国有代表性的 36 个玉米优良自交系，发现在基因组的非编码区中平均每 31 个碱基就有一个 SNP 差异，在非编码区还有高频率的插入和缺失，平均每 85 个碱基就有一个这样的差异。Tenaillon 和Rafalski 报道在玉米平均 104bp 就有一个 SNPs，其差异的水平比人类和果蝇都要高的多：基因的 3端非翻译区和编码区分别有每 48 个碱基和 130 个碱基就有一个 SNP 差异。1112 玉米遗传连锁图谱构建玉米遗传连锁图谱构建以遗传距离表示基因
12、组内基因座相对位置的图谱，称为基因组的遗传图谱。遗传距离是指细胞在减数分裂过程中两个基因座发生交换的频率，单位是厘摩尔(centi-Morgan，cM)。当两个基因座之间发生 1的重组率时，其遗传距离大约为 1 个 cM。检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析、利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用分子标记构建遗传连锁图谱，在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。主要步骤包括：选择合适的亲本，并构建适宜的作图群体；选择适合作图的 DNA 标记：测定作图分离群体中不同个体
13、或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图谱。1.选择合适的作图群体选择合适的作图群体玉米上常见的作图群体有初级群体(F2，BCl，RIL，硼等)，次级群体(NILs，ILs，CSSLs 等)和高级群体(SSSL 等)(席章营，2005)。F2 群体：作为初级作图群体，及其衍生的 F2：3 家系群体属于临时性分离群体，显著特征是群体中的每个个体及其后代均可发生分离。F2 群体易配制，且提供的遗传分析信息最为丰富，在凹 L 作图中可以同时估计加性效应和显性效应。回交(BC)群体：每一分离基因座的两种基因型直接反映了 F1 代配子的分离比例，因而作图效率最高。回交群体与 F2
14、 群体相比，同源染色体间重组交换机率减少12，因此所提供的信息量只有 F2 的一半。同时回交群体也是临时性群体，容易获得。重组自交系(Recombinant inbred 1ines，RIL)群体：作为初级作图群体，又属于永久性分离群体。RIL 群体是杂种后代经过连续多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2 单株采用单粒传方法建立起来。RIL 群体由于在连续自交过程中染色体配对和重组增加，因而可以更精确地定位那些紧密连锁的位点，QTL 作图比 F2 分辩率要高(Burr B，Burr FA，1991)。RIL 群体每个株系都是纯合的，是一种可以长期使用的永久性分离群体，可满足不同时间、不同研究
15、者使用，有利于提高遗传图谱的密度和 QTL 定位的准确性。但建立这种群体需要花费较长时间，如玉米要建立完全纯合的 RIL 作图群体，至少需要自交 15 代(吴为人等，1997)。实践中，人们选用自交 6-7 代的“准”RIL 群体来构建分子标记连锁图谱也是可行的。1.构建遗传连锁图构建遗传连锁图以遗传距离表示基因组内基因座相对位置的图谱，称为基因组的遗传图谱。遗传距离是指细胞在减数分裂过程中两个基因座发生交换的频率，单位是厘摩尔(centi-Morgan，cM)。当两个基因座之间发生 1的重组率时，其遗传距离大约为 1 个 cM。遗传图谱的构建是基因定位的第一步，是基因克隆、基因组结构与功能研
16、究的基础。遗传图谱的构建一般采用形态标记、细胞学标记、蛋白质标记和 DNA 分子标记等 4 种遗传标记。上世纪 80 年代以前主要采用前三种遗传标记，所构建的遗传图谱也称经典遗传图谱。经典遗传图谱的构建在理论上进一步证实了基因在染色体上呈直线排列的染色体遗传理论，在方法和原理上对后来的分子标记连锁遗传图谱的构建具有重要的指导意义，在实践上对遗传育种工作起到了很大的推动作用。进入 20 世纪 80 年代后，分子标记得以广泛开发和应用，如 RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP，具有数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制、不受环境影响以及共显性的特点，是在 DNA 水平上对遗传变异的直接反映，从而促进遗传图谱的构建由经典遗传图谱时期发展到以DNA 分子标记为主的遗传图谱时期，促进了遗传图谱向高精确度和高分辩率迅速发展，为遗传图谱的构建及其应用建立了一个新的里程碑。此外分子生物学和基因克隆技术的发展，使得大量基因和 cDNA 片段被克隆分离，进一步为遗传图谱的构建提供了丰富的材料。早在 1935 年，Emerson 等构建了包
