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1、m i R - 3 0 a 3 p 在肝癌中的表达、功能及机制研究 论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1 ：周韧教授浙江大学医学院评阅人2 ：洪德飞主任医师浙江省人民医院评阅人3 ：吴健主任医师浙江大学医学院附属第一医院评阅人4 ：评阅人5 ：答辩委员会主席：叶再元教授浙江省人民医院委员1 ：黄东胜主任医师浙江省人民医院委员2 ：吴育连主任医师浙江大学医学院附属第二医院委员3 ：牟一平教授浙江大学医学院附属邵逸夫医院委员4 ：邵钦树主任医师浙江省人民医院委员5 ：答辩日期：2 0 1 3 年5 月2 2 日浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究
2、工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：鼢签字日期：矿，多年厂月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保耷的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作
3、者签名：导师签名：签字日期：矽，声厂月步签字日期：首埘泰 册年厂月V 乡日浙江大学硕士学位论文致谢逝者如斯，不舍昼夜，两次春去春又来，岁月稍纵即逝。在此，向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。“饮其流时思其源，成吾学时念吾师。”首先感谢我的导师郑树森院士，他以敏锐的洞察力、渊博的知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风和对科学的献身精神给我留下了刻骨铭心的印象，这些将成为我终身献身科学和献身事业的动力。诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。他不但给我提供了良好的学习、研究和实验环境，还有极为丰富的与通道交流和沟通的平台。毕业在即，在此谨向您表示我
4、最衷心的感谢!其次，我要感王伟林教授、周琳教授，他们给予我最耐心的指导、最大的信任及鼓励；另外，还要感谢器官移植重点实验室谢海洋、宋朋红、沈克震、王雁、鱼达、余晓波、成俊等全体老师，各位老师道德与学术并重，宽容博大的胸襟、谦逊朴素的为人，令我如沐春风，倍感温馨。还要感谢黄小松、陈雷明、曹国强、陈辉、洪良杰、姜丽、宋文峰、苏蓉、杨晶、曹吉莉、胡启超、张凤丽等全体技术人员提供的无私帮助! 他们也都一直对我的科研、学习和生活给予最大的帮助!同时，感谢张武、杨拮、丁松明、徐致远、高晟、陈康杰、邢春阳、魏巴金、周武华、孙强、谢青松、程小飞、周东楷、刘治坤、吕震、张晨曦、郭海军、孙飞、王建国等师兄弟们的热
5、情帮助和陪伴。最后，感谢家人永恒的支持!林华山2 0 1 3 年4 月3 0 日浙江大学硕士学位论文中文摘要m i R - 3 0 a 一3 p 在肝细胞肝癌的表达、功能及机制研究背景与目的：浙江大学医学部外科学硕士研究生林华山导师郑树森院士中文摘要小分子R N A ( m L l A s ) 是长度约l S - 2 2 b p 的短链非编码R N A ，通过抑制靶基因的蛋白翻译而调节生理和病理过程。m i R - 3 0 a - 3 p 的差异表达己在多种癌症中证实，然而，m i R - 3 0 A - 3 p 在肿瘤中的细胞学功能鲜有报道，并且m i R - 3 0 a - 3 p 在肝细
6、胞肝癌( H C C ) 的角色也是未知。本研究的目的是阐述m i R - 3 0 a - 3 p 在肝癌的细胞学功能及潜在分子机制。方法：本研究首先分析m i R - 3 0 a - 3 p 在1 1 0 对肝癌标本及l o 个肝癌细胞株中的表达水平。在肝癌细胞系B e l 7 4 0 2 高表达m i R - 3 0 a - 3 p ，然后观察它对细胞生长克隆、周期凋亡、侵袭转移等功能学的作用。最后通过W e s t e r n B l o t 、双荧光素梅报告基因验证m i R 3 6 a - 3 p 与潜在靶基因之间的调控模式。结果：我们的研究结果表明，与癌旁组织相比，m i R -
7、3 0 a - 3 p 在8 3 6 的肝癌肝癌中浙江大学硕士学位论文中文摘要表达水平显着下调( P ocln门on叱一E浙江大学硕士学位论文结果我们进行m i R 3 0 a 3 p 表达水平- 9 肝癌患者临床病理特征之间的相关性研究。在此分析中，1 l O 例肝癌患者被分为m i R 3 0 a 3 p 高表达组和低表达组。结果表明，年龄、性别、肝硬化、A F P 水平、肿瘤大小、肿瘤数目或组织学分级无显著统计学意义( 表1 ) 。然而，相对于m i R 一3 0 a 一3 p 高表达组，m i R 一3 0 a 一3 p 低表达组门静脉癌栓的发病率显著增高( P = 0 0 0 9 )
8、 。这暗示m i R 3 0 a 3 p 可能在H C C 血管浸润和转移中发挥重要作用。表1 ，m i R 3 0 a 3 p 与肝癌临床参数相关性分析。肝癌切除后的H C C 患者分为m i R 3 0 a 3 p 高表达组和低表达组，数据用P e a r s o n 卡方检验或双侧F i s h e r 精确检验进行评估，木P 一佰c一浙江大学硕士学位论文结果( A ) m i R 3 0 a 一3 p 对肝癌细胞侵袭能力的影响；( B ) m i R 一3 0 a 3 p 对肝癌细胞迁手冬能力的影响；( C ) 和( D ) 柱状图对侵袭和迁移细胞数目定量分析，P 值是三次 虫立实验的
9、均数标准差，一c P o 0 5 。4 4m i R - 3 0 a 一3 p 抑制肝癌细胞生长在C C K - 8 实验中，B E L 一7 4 0 2 经过m i R 3 0 a - 3 pm i m i c s 转染后，在3 0 h 、6 0h 、0 0h 和1 2 0h 的增殖曲线明显低于对照组( 图3 A ) 。在平板克隆形成实验中，与对照组相比，m i R 3 0 a 3 pm i m i c s 转染组的克隆数目显著减少( 图3 B )m i R N C2 瑚o o ；2 0 031 西o oZO图3C C K 8 和克隆形成实验检测m i l l 3 0 a - 3 p 对肝癌
10、细胞生长的作用( A ) B E L 7 4 0 2 经m i R 3 0 a 3 pm i m i c s 转染后在不同时间点增殖曲线的变化。( B ) m i R 一3 0 a 一3 p 抑制肝癌细胞克隆形成，右侧柱状图对克隆数目定量分析，P 值是三次独立实验的均数标准差，木P 0 0 5 。5O5O5O22，1OOuc心口-IO协互傅fA谨B浙江大学硕士学位论文结果4 5m i R 3 0 a 3 p 促进肝癌细胞凋亡并诱导周期阻滞接下来，我们评估m i R 3 0 a 一3 p 在肝癌细胞凋亡和细胞周期中的作用。如图4 A 所示，B e l 一7 4 0 2 转染7 2 h 后，m i
11、 R 一3 0 a 一3 pm i m i c s 组的凋亡细胞百分比显著高于对照组( Q 2 + Q 4 ，P = 0 0 1 3 ) 。此外，细胞周期分析提示，m i R 一3 0 a 一3 pm i m i c s 组和对照组在细胞周期不同阶段的细胞数的比率分别如下：G 0 G 1 期，5 2 5 7 对3 4 3 ；S 期，2 6 8 6 对5 1 2 ；G 2 M 期，2 0 5 7 对1 4 5 ( 图4 B ) 。m i R 一3 0 a 一3 p 的过表达导致s 期细胞明显增多而G 2 M 期细胞显著减少，提示发生了s 期到G 2 M 期转变的阻滞。ABt l I 卜j l ?
12、 p 、2 6 f ? 。一 I - 2 、I 二二? n。A LJ一j4 o 19-q 0 叁i 拶jl J缀 嚣 m C 1 - U o C一 价=m L )图4m i R 3 0 a 3 p 对肝癌细胞凋亡和周期的作用( A ) m i R 3 0 a 一3 p 促进肝癌细胞凋亡。右侧柱状图对细凋亡胞数定量分析，P 值是三次独立实验的均数标准差，术P O 0 5 。( B ) m i R 一3 0 a 一3 p 诱导肝癌细胞S 期到G 2 M 期转变的阻滞。右侧柱状图对细胞周期不同阶段细胞数定量分析，P 值是三次独立实验的均数标准差，术P O 0 5 。2 4浙江大学硕士学位论文结果4
13、6m i R - 3 0 a - 3 p 调节v i m e n t i n 、E - c a d h e r i n 和M M P 3 蛋白的表达上皮间质化( E M T ) 的标记物如v i m e n t i n 、E c a d h e r i n 、s n a i l 和N c a d h e r i n 的是早期肿瘤向侵袭性肿瘤进展的重要标志的关键。此外，金属蛋白酶家族( M M P s ) 在肿瘤细胞的侵袭和迁移中也至关重要。在这里，我们评估的m i R 3 0 a 3 p 是否可以在肝癌中调节E M T 和M M P s 标记物。如图5 中所示，m i R 3 0 a 3 p
14、过表达显着降低V i m e n t i n 和M M P 3 蛋白的表达并同时上调E c a d h e r i n蛋白水平，但对其他E M T 相关的标记物( N c a d h e r i n 、s n a i l 、c l o u d i n 1 和Z 0 1 )及M M P I ，M M P 2 ，M M P 9 ，M M P l 3 和M M P l 4 的表达无明显影响。A、7i m e n t i n0 1p a c t i n黼峨，。e0 fN t L x , 1 P 14 _ ，1 3 一a c t in图5m i R - 3 0 a 3 p 调节E M T 及I I V
15、I A I P s 相关蛋白3l2I；PP雕丐FI1Il，M“盯B 一 一 一浙江大学硕士学位论文结果4 7双荧光素酶报告基因证实m i R 3 0 a - 3 p 靶向调节v i m e n t i n 和为进一步验证m i R 3 0 a 3 p 对M M P 3 和V i m e n t i n 的靶向作用，我们把这两个基因的3 - U T R 全长分别构建到双荧光素酶载体上，进行双荧光素酶报告验证试验。转染人肾上皮细胞系2 9 3 T 细胞4 8 h 后，m i R N C + M M P 3 3 U T R 、m i m i c + M M P 3 3 U T R 、m i R N
16、C + V i m e n t i n 一3 U T R 与m i m i c + V i m e n t i n 一3 U T R 的相对荧光强度分别为7 1 2 、4 8 0 、8 7 4 和6 6 7 ( 图6o 与对照组相比，转染m i R 一3 0 a 一3 p后M M P 3 的相对荧光强度下降3 2 5 ，V i m e n t i n 的相对荧光强度下降2 3 7 。由此可见，m i R 一3 0 a 3 p 可直接或间接靶向调节M M P 3 和V i m e n t i n 的3 - U T R 。m i R N C ：- t - m i R - 3 0 a - 3 pm im i c s ：- M M P 3 3 U T R ：+ V i
