《As2O3对人乳腺癌裸鼠移植瘤作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《As2O3对人乳腺癌裸鼠移植瘤作用的研究（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学硕士学位论文AsO对人乳腺癌裸鼠移植瘤作用的研究姓名：陈鑫申请学位级别：硕士专业：外科学（普通外科）指导教师：吴诚义2003.5.1重庆医科大学硕士学位论文符号A IA s 2 0 3A N O V AB c l 2D D PD N AF 一R A gF C MK i 6 7 一L IM M P 9M V DP B SS PS N KT E MT I M PT U N E LV E G F符号说明英文名称A p o p t o s i si n d e xA r s e n i cT n o d eA n a l y s i so fv a r i a n c eB c e l l
2、t y m p h o m a l e u k e m i a - - 2C i s p l a t i nD e o x y r i b o n u c l e i ca c i dF a c t o r 一r e l a t e da n t i g e nF l o wc y t o m e t r yK i 6 7l a b e li n d e xM a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s eI XM i c r o v e s s e ld e n s i t yP h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i
3、 n eS t r e p t a v i d i n p e r o x i d a sS t u d e n tN e W l T l a nK e u l sT r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p eT i s s u ei n h i b i t o ro fm e t a l l o p r o t e i n a s eT e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d et r a n s f e r s a em e d i a t e dd u T Pn i c ke n
4、 dl a b e l i n gV a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r中文名称凋亡指数三氧化二砷方差分析B 细胞淋巴瘤白血病一2 基因顺铂脱氧核糖核酸八因子相关抗原流式细胞术K i 6 7 标记指数基质金属蛋白酶9微血管密度磷酸盐缓冲液过氧化酶标记的链霉卵白素多个样本均数间每两个均数之间的q 检验透射电子显微镜金属蛋白酶组织抑制因子末端脱氧核苷酸转移酶介导的d u T P 缺口末端标记法血管内皮细胞生长因子重庆医科大学硕士学位论文第一部分搦乎A s 。0 。对人乳腺癌裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影晌f 丽。重、1一。弋、
5、 L 一目的：研究A s ：0 。人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤的抑制作用，探讨其抗肿瘤的作用机制。， 方法：建立人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植瘤的模型，2 2 只荷瘤( 鼠随机对照分为四组：阴性对照组( 生理盐水) 、阳性对照组( D D P I 5 m g k g ) 、实验组1 ( A s ：0 。1 5m g k g ) 、实验组2 ( A s ：0 。3 0m g k g ) 。连续经尾静脉注射用药7 天，观察用药后各组肿瘤的受抑制的作用。采用血细胞计数、骨髓涂片、透射电镜、流式细胞仪观察和分析，免疫组化检测K i 6 7 、b c l 一2 的表达，在肿瘤标本中用T U N E L法进行
6、原位细胞凋亡检测。结果：1 A s ：O ，对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用：A s 。O 。作用后移植瘤的瘤重、平均肿瘤体积均低于两对照组。两组A s ：0 。作用后的抑瘤率分别是7 9 6 9 、7 8 1 8 而阳性对照组的抑瘤率是5 4 5 5 ，差异有显著性( F ( O 0 5 ) 。不同浓度的A s 。0 组的抑瘤作用差异无显著性( P ) O 0 5 ) 。重庆医科大学硕士学位论文2 透射电镜观察：实验组1 和实验组2 的肿瘤标本在电镜下可见典型凋亡形态学改变，而阳性和阴性对照组未见此现象。3 流式细胞仪分析：实验组1 和实验组2 和阳性对照组的肿瘤标本中均可见有G l 期细胞形
7、成的凋亡峰，凋亡率分别是1 2 6 、4 0 、i 1 3 ，提示A s ：0 。的凋亡率较高。另骨髓标本中实验组1 、2 和阴性对照组比阳性对照组的D N A 含量高，提示顺铂组骨髓有核细胞较少，增生能力下降。4 K i 6 7 免疫组化染色表达：实验组l 和实验组2 和阳性对照组的K i 6 7 标记指数比阴性对照组低，差异有显著性( 尺O 0 5 ) ，但实验组i 和实验组2 和阳性对照组之间差异无显著性( D 0 0 5 ) ，提示A s ：0 。有抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤细胞增殖的作用。5 b c l 一2 免疫组化染色表达：实验组1 和实验组2 和阳性对照组的b c l 一2 表达低
8、于阴性对照组，差异有显著性( P 0 0 5 ) A f t e rt h ea d m i n i s t r a t i o no fD D P , t h eg r o w t ho fs o l i dt u m o rw e r ea l s oo b v i o u s l yi n h i b i t e d T h ei n h i b i t o r yr a t ew e r e5 4 5 5 ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u pD D Pa n dg r
9、o u p sA s 2 0 3 ( P 0 + 0 5 ) ，T h e s ei n d i c a t e dt h a tA s 2 0 3c o u l di n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fg r a f tt u m o rc e l l I m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n go fb c l 一2s h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nf o u rg r o u p s
10、 ( P O 5 c m 后，随机分为阴性对照组( 生理盐水) 和阳性对照组( 顺铂1 5 m g k g ) ，每组5 只裸鼠；实验组1 ( A s ：0 。1 5 m g k g ) 和实验组2 ( A s ：0 。3 O m g k g ) ，每组6只裸鼠。每组均经尾静脉注射用药，连续7 天。( 二) 用药后移植瘤的测量及疗效观察每日观察各组裸鼠的精神、饮食、活动的一般情况，记录鼠体重的变化。停药后第2 天处死动物，游标卡尺测量肿瘤长径( a ) 和横径( b ) ，计算肿瘤体积，瘤体积= ( a b 2 ) 2 “：完整剥取肿瘤，称重，计算肿瘤抑制率。瘤重抑制率= ( 卜用药组均值阴性
11、对照组均值)x1 0 0 。生化分析仪计数裸鼠血常规，和鼠股骨骨髓常规涂片计数。( 三) 透射电镜观察处死动物后1 分钟内将l m m 3 实体瘤标本以2 戊二醛固定、1 锇酸再固定，系列脱水、浸透包埋、半薄切片1 甲苯胺蓝一天青I I 染色、光镜定位、超薄切片染色，透射电镜观察摄片。( 四) 流式细胞术分析组织切片一胃蛋白酶消化法获取肿瘤组织细胞悬液，即将l m m 大小的组织块剪碎，再用生理盐水漂洗剪碎的组织块后，加入0 5 ( p H l 5 ) 胃蛋白酶( 1 0 m l g ) ，3 7 消化3 0 分钟，并间断振荡吹打，终止消化后滤网过滤，离心沉淀得单细胞悬液。骨髓细胞7 0 乙醇
12、固定后制成悬液，用9重庆医科大学硕士学位论文流式细胞仪行D N A 含量分析。( 五) 免疫组化染色实验步骤1 移植瘤标本以4 多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，切片厚5 6 u r n ，5 0烘箱烘烤2 小时后，烘箱保存备检。2 K i 6 7 免疫组化检测( 1 ) 石蜡切片5 6 。C 纯二甲苯脱蜡5 分钟，1 0 0 、9 5 、8 0 、7 5 系列酒精逐级水化，用P B S ( P H = 7 2 ) 冲洗3 次，每次3 分钟。( 2 ) 滴加3 的过氧化氢于切片标本上，室温孵育5 1 0 分钟，以去除内源性过氧化氢酶的活性，再用P B S 冲洗3 次，每次3 分钟。( 3 )
13、将切片浸入O 0 1 M ( P H = 6o ) 枸橼酸溶液中，T C L 微波炉高温热修复抗原5 分钟，冷却至室温后蒸馏水冲洗3 次，每次3 分钟。( 4 ) 滴加封闭用正常动物血清于切片标本上，室温孵育l O 1 5 分钟，倾去。( 5 ) 滴加鼠抗人K i 一6 7 单克隆抗体于切片标本上，4 。C 过夜，另用P B S 代替一抗作空白对照。用P B S ( P H = 7 2 ) 冲洗3 次，每次3 分钟。( 6 ) 滴加生物素标记的第二抗体于切片标本上，室温孵育l O 1 5 分钟，用P B S 冲洗3 次，每次3 分钟。( 7 ) 滴加过氧化酶标记的链霉卵白素于切片标本上，室温孵
14、育1 0 1 5 分钟，用P B S 冲洗3 次，每次3 分钟。( 8 ) 用新鲜配制的D A B 液滴加于切片标本上，在显微镜下控制显色1 分钟左右，待阳性部位细胞核出现特异性显色，而背景无着色时清水冲洗，终止显色。( 9 ) 苏木素复染，自来水冲洗还蓝，风干后二甲苯透明，中性树胶封固，封片。( 1 0 ) 在低倍镜下确定5 个K i 6 7 染色阳性细胞视野，在高倍镜下每个视野数2 0 0 个肿瘤细胞，以阳性细胞的百分数为K i 6 7 标记指数“1 。3 B c l 2 免疫组化检测( I ) 同2 中( 1 ) 一( 4 ) 的步骤。l O重庆医科大学硕士学位论文( 2 ) 滴加鼠抗人
15、b c l 一2 蛋白单克隆抗体于切片标本上，4 。C 过夜，另用P B S代替一抗作空白对照。用P B S ( P H = 7 2 ) 冲沈3 次，每次3 分钟。( 3 ) 同2 中( 6 ) 一( 7 ) 的步骤。( 4 ) 用新鲜配制的D A B 液滴加于切片标本上，在显微镜下控制显色1 分钟左右，待阳性部位细胞浆出现特异性显色，而背景无着色时清水冲洗，终止显色。( 5 )苏木素复染，自来水冲洗还蓝，风干后二甲苯透明，中性树胶封固，封片。( 6 ) 随机选取1 0 个视野计数1 0 0 0 个细胞，依照阳性细胞百分比判断，阳性率 0 0 5 ) 。说明在外观测量上不同浓度的A s 2 0
16、 3 的抑瘤作用差异无显著性( P O 0 5 ) 。但在细胞化学检Nt - ，我们发现不同浓度的A s 2 0 3作用后的移植瘤b c l 2 表达的差异有显著性( P O 0 5 ) 。目前一些研究证明肿瘤发生过程不是细胞增殖活性提高，而是肿瘤细胞发生死亡的能力和倾向降低了旧。其意义在于我们寻找肿瘤治疗新方法和新药物时应该集中在提高肿瘤发生凋亡的能力上，而不是单纯抑制肿瘤细胞的增殖过2 1重庆医科大学硕士学位论文程。关于凋亡指数与肿瘤大小的关系意见不一，一些认为有关即凋亡越强，肿瘤越小，愈后越好；一些2 0 1 认为无关即单一凋亡指数的改变与肿瘤大小无相关性。我们认为肿瘤大小由多种因素确定，其与凋亡指数的关系是一种质与量的关系，即细胞凋亡是个量变的过程，而肿瘤重量和体积大小是个质变过程。实验中我们比较了其凋亡增殖比率，秩和检验表明不同浓度的A s 2 0 3 的凋亡增殖比率是不
